摘要：

目的：探討氫(H2)對(duì)大鼠角膜堿燒傷模型中銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)活性的影響。方法：每只大鼠的一個(gè)角膜接受堿暴露。堿暴露前和堿暴露后，分別在角膜上持續(xù)滴注生理鹽水(生理鹽水組)或氫溶解鹽水(H2組)5min。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩組摘除眼的炎細(xì)胞、新生血管和胞漿SOD1水平。用低真空掃描電子顯微鏡分析眼內(nèi)三維超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：H2組角膜炎癥細(xì)胞數(shù)和血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.01)。此外，H2處理還可增加角膜上皮細(xì)胞胞漿SOD1水平(P<0.01)和活性(P<0.01)。值得注意的是，H2組的SOD1活性水平大約是生理鹽水組的2.5倍。結(jié)論：H2治療可抑制角膜損傷后炎癥反應(yīng)和新生血管形成，并通過上調(diào)SOD1酶蛋白水平和活性間接抑制角膜氧化損傷。

引言：

自2007年我們首次提出氫氣（H2）通過選擇性還原細(xì)胞毒性氧自由基作為治療性抗氧化劑以來，已有多項(xiàng)研究證明了氫氣的作用，并提出了其在治療方面的應(yīng)用潛力。因此，H2醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，目前有超過25項(xiàng)臨床研究（包括雙盲臨床試驗(yàn)）正在評(píng)估H2的治療效果。更具體地說，眼科研究人員已經(jīng)報(bào)道了H2在視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞、角膜堿燒傷和白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)中直接降低氧化應(yīng)激的應(yīng)用。但值得注意的是，也有報(bào)道稱H2可通過其他途徑間接抑制氧化應(yīng)激。

細(xì)胞質(zhì)Cu、Zn超氧化物歧化酶（SOD1）參與抗氧化應(yīng)激，其活化是H2醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)途徑。SOD1可調(diào)節(jié)活性氧水平，從而在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。有報(bào)告顯示，H2參與了SOD1的活性，并認(rèn)為前者間接抑制了抗氧化應(yīng)激。但迄今為止，很少有報(bào)告描述H2在眼科環(huán)境中激活SOD1的作用。

因此，在本研究中，我們通過明確H2對(duì)角膜堿燒傷模型中SOD1活性的影響，評(píng)估了H2對(duì)炎癥和新生血管形成的影響，以及對(duì)氧化應(yīng)激的間接影響。

材料與方法：

倫理批準(zhǔn)：

所有基于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均遵照日本醫(yī)科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行。所有程序均符合視覺研究協(xié)會(huì)和眼科與視覺研究協(xié)會(huì)的指導(dǎo)方針。

動(dòng)物：

八周大的雄性Wistar大鼠，體重200克。大鼠飼養(yǎng)在特定的無病原體環(huán)境中，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中提供水和食物，并提供持續(xù)的臨床護(hù)理（每天24小時(shí)/每周7天），以確保在需要時(shí)及時(shí)干預(yù)。

堿燒傷模型和H2溶解生理鹽水的制備：

在3.5%異氟醚吸入麻醉下，每只大鼠的一只眼睛（共104只）按照以下方案進(jìn)行堿燒傷：將一張浸泡在1mol/L NaOH中的圓形濾紙放在角膜中央1分鐘。在堿暴露前用生理鹽水（生理鹽水組：39只）或H2溶解生理鹽水（H2組：39只）滴注（10mL/min）沖洗角膜5分鐘，并在堿暴露后再次沖洗角膜。每只大鼠均以未受傷的正常角膜作為對(duì)照。

H2溶解生理鹽水的制備方法見我們之前的報(bào)告:

簡(jiǎn)而言之，將市售生理鹽水塑料袋放入充滿H2氣體的丙烯酸真空室中24小時(shí)（圖1A）。使用前，使用針式H2電極（Unisense，丹麥奧胡斯）確認(rèn)每個(gè)袋中H2的溶解濃度。在所有實(shí)驗(yàn)中，溶解了H2的生理鹽水都是在從真空室取出后5分鐘內(nèi)使用的。

堿傷后6小時(shí)、1天和7天，在3.5%異氟醚吸入麻醉下，對(duì)大鼠進(jìn)行放血安樂死。對(duì)去核眼球進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化檢查，并進(jìn)行低真空掃描電子顯微鏡檢查。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)。

組織學(xué)和免疫組化分析及LVSEM觀察：

將去核眼球（每組/每個(gè)終點(diǎn)n=8只）固定在10%的緩沖福爾馬林中，用石蠟包埋，然后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。隨后，去石蠟組織切片（厚度：2.5μm）用蘇木精和伊紅（HE）染色，用NaphtolAS-D氯乙酸酯酶（EST）檢測(cè)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞，并用LV-SEM染色。對(duì)于后者，用周期性酸-甲酚胺銀（PAM）對(duì)組織進(jìn)行染色，以明確膠原。

為了對(duì)炎癥細(xì)胞、新生血管和SOD1酶水平進(jìn)行免疫組化分析，在兩個(gè)角膜區(qū)域（中心：3個(gè)視野，周邊：2個(gè)視野）的高倍視野（放大率：400×）中對(duì)每個(gè)樣本的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行病理測(cè)量。使用的一抗如下

1）單克隆小鼠抗氨基肽酶P抗體（JG12）用于檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞；

2）單克隆小鼠抗8-OHdG抗體（JaICA）用于檢測(cè)DNA氧化應(yīng)激；

3）單克隆小鼠抗CD68抗體（ED1）；

4）單克隆小鼠抗CD163抗體（ED2）檢測(cè)M2巨噬細(xì)胞；

5）多克隆兔抗SOD1抗體（Stressgen）檢測(cè)SOD1酶。

如上所述，用于LV-SEM的樣本需進(jìn)行PAM染色以增強(qiáng)對(duì)比度。用PAM染色后，通過LV-SEM對(duì)沒有安裝蓋玻片的標(biāo)本進(jìn)行檢查。使用15kV的加速電壓和30Pa的反向散射電子探測(cè)器評(píng)估角膜傷口的超微結(jié)構(gòu)變化。

統(tǒng)計(jì)分析：

所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。統(tǒng)計(jì)分析使用分析軟件程序進(jìn)行。比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。