摘要

井岡霉素A(Val-A)是由鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用于防治水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病。本研究探討了堿性pH沖擊對提高Val-A產(chǎn)量的影響及其機(jī)制。通過使用氫氧化鈉進(jìn)行一次或多次沖擊處理，獲得了更高的Val-A產(chǎn)量，同時伴隨更快的蛋白質(zhì)合成和糖消耗，堿性pH沖擊可使Val-A產(chǎn)量提高27.43%。與氨基酸代謝、碳代謝和電子呼吸鏈相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，同時呼吸活性和谷氨酸濃度大幅增加。Val-A產(chǎn)量的提高是通過一系列復(fù)雜機(jī)制實現(xiàn)的，并響應(yīng)了pH脅迫信號，這導(dǎo)致了谷氨酸代謝和呼吸活性的增強(qiáng)。所獲得的信息將有助于未來提高抗生素產(chǎn)量的研究以及分子機(jī)制的深入揭示。

1.引言

井岡霉素A(Val-A)是由工業(yè)菌株吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008發(fā)酵產(chǎn)生的抗真菌抗生素，已在東亞地區(qū)廣泛用作防治水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病的首要藥劑。提高Val-A產(chǎn)量已引起廣泛關(guān)注，但似乎對提高生產(chǎn)率收效甚微。pH是微生物代謝的綜合反映，因此影響發(fā)酵過程和細(xì)胞生長。pH可影響代謝方向，并且不同階段生長和產(chǎn)物合成的最適pH也不同。相同的微生物在不同的環(huán)境pH條件下可能產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。例如，黑曲霉(Aspergillus niger)在pH 2-3下發(fā)酵蔗糖主要產(chǎn)生檸檬酸，但當(dāng)pH變?yōu)?時，主要產(chǎn)生草酸(Lu et al.,2016)。因此，在發(fā)酵過程中，采用適當(dāng)?shù)牟呗钥刂苝H可以獲得所需產(chǎn)物。

發(fā)酵pH對鏈霉菌發(fā)酵也有很大影響，其中一些菌株具有特定的響應(yīng)措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一種抗生素，在不同培養(yǎng)階段也需要不同的pH才能獲得最高產(chǎn)量。根據(jù)Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一種兩階段pH控制策略，即在培養(yǎng)112小時后將培養(yǎng)pH從5.5轉(zhuǎn)變?yōu)?.8，以提高恩拉霉素(enduracidin)的產(chǎn)量，生產(chǎn)率提高了51.2%。再比如，通過基于原位pH監(jiān)測的種子階段開發(fā)，ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine)的產(chǎn)量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

環(huán)境脅迫一直是提高鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵途徑，環(huán)境信號可以通過啟動復(fù)雜的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(Li et al.,2016)。鏈霉菌根據(jù)不同類型的環(huán)境因素，擁有許多獨特的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。在天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中，pH沖擊誘導(dǎo)了放線紫紅素(actinorhodin)的調(diào)控基因和生物合成基因的過表達(dá)(Kim et al.,2007,2008)。此外，在鏈霉菌(Streptomyces sp.)CK4412中，推定的酸沖擊誘導(dǎo)基因SCO7832的表達(dá)通過途徑特異性調(diào)控基因的過表達(dá)刺激了tautomycetin的產(chǎn)量(Park et al.,2009)。此外，雙組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system)也是一種非常重要的調(diào)控方式。據(jù)報道，雙組分系統(tǒng)DraR/DraK參與了天藍(lán)色鏈霉菌中抗生素生物合成的調(diào)控(Yeo et al.,2013)。在白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18中，研究了其對酸性pH以實現(xiàn)高產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的生理響應(yīng)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫響應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、DNA和RNA代謝以及核糖體亞基相關(guān)的基因在酸性pH響應(yīng)中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，關(guān)于pH沖擊對Val-A產(chǎn)量及生物合成途徑基因表達(dá)影響的信息很少，而這些信息對于改進(jìn)抗生素發(fā)酵和降低成本具有重要價值。直到最近，我們首次采用堿性pH沖擊來增強(qiáng)Val-A產(chǎn)量，并初步確定用于pH沖擊的適宜pH約為8.0(Zhou et al.,2016)。

本工作旨在研究pH沖擊對Val-A發(fā)酵過程的影響，并揭示pH與Val-A產(chǎn)量之間的關(guān)系?；谖溍咕鶶.hygroscopicus 5008在不同pH沖擊條件下合成Val-A的產(chǎn)量變化規(guī)律以及最新的基因組研究進(jìn)展，研究了pH對基因表達(dá)的影響及其在生理水平上的規(guī)律，以探索pH沖擊提高Val-A產(chǎn)量的機(jī)制。首先，選擇pH作為環(huán)境脅迫來提高Val-A產(chǎn)量，進(jìn)行了代謝活性分析，并構(gòu)建了包含pH沖擊的高效發(fā)酵策略。此外，依次探討了pH沖擊對基因表達(dá)和細(xì)胞微環(huán)境的影響。最后，全面討論了pH沖擊對Val-A產(chǎn)量的作用機(jī)制。據(jù)我們所知，這是在Val-A發(fā)酵上采用環(huán)境脅迫的首次嘗試。它也可為其他放線菌生產(chǎn)抗生素提供良好的參考。