2.材料與方法

2.1.微生物與發(fā)酵條件

所用菌株吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008(CGMCC 4.1026)是一種工業(yè)上生產(chǎn)Val-A的菌株，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

孢子瓊脂培養(yǎng)基組成如下：豆粕20 g/L，麥芽糖20 g/L，瓊脂20 g/L。用2 mol/L NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，并在121°C高壓滅菌20分鐘。在37°C培養(yǎng)八天后收集孢子，懸浮于20%(v/v)甘油中，-80°C保存?zhèn)溆谩?

種子培養(yǎng)基組成如下：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接種50μL孢子懸液(1.5 x 10?cfu/mL)后，在37°C，220 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上，在250mL搖瓶（含50 mL種子培養(yǎng)基）中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

對(duì)于Val-A生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：玉米粉100 g/L，豆粕25 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 1 g/L，KH2PO4 1.5 g/L。將5 mL種子培養(yǎng)物接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在37°C，220 rpm下發(fā)酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.Val-A生產(chǎn)的pH沖擊策略

2.2.1.不同堿性溶液進(jìn)行pH沖擊

當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行24小時(shí)時(shí)，分別通過添加2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，將不同處理組的發(fā)酵液pH從自然pH 6.4調(diào)節(jié)至pH 8.0。

2.2.2.pH沖擊的不同時(shí)間點(diǎn)

六個(gè)不同處理組的發(fā)酵分別持續(xù)4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后通過添加2 mol/L NaOH將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至pH 8.0，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

2.2.3.不同處理次數(shù)

三組設(shè)置如下：

?單次pH沖擊處理：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20小時(shí)時(shí)，通過添加2 mol/L NaOH將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至pH 8.0。

?兩次pH沖擊處理：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20小時(shí)和44小時(shí)時(shí)，用2 mol/L NaOH將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至pH 8.0。

?三次pH沖擊處理：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20小時(shí)、44小時(shí)和68小時(shí)時(shí)，用2 mol/L NaOH將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至pH 8.0。

2.3.細(xì)胞重量、殘留碳源和Val-A產(chǎn)量的分析

每天取2mL發(fā)酵液樣品用于分析細(xì)胞重量、殘留碳源和Val-A產(chǎn)量。樣品在12,000g下離心5分鐘。取0.5mL上清液，用等體積的氯仿萃取，然后用0.22-μm親水性濾膜過濾。含有Val-A的過濾樣品采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分析(Iwasa et al.,1971)。由于種子培養(yǎng)基中的玉米粉和豆粉不溶，標(biāo)準(zhǔn)的干重法不可行，因此使用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)以反映細(xì)胞生長(zhǎng)(Kieser et al.,2000)。培養(yǎng)基中的總殘留糖（作為碳源）采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-硫酸法測(cè)定(Liao et al.,2009)。

2.4.胞外和胞內(nèi)pH測(cè)量

胞外pH(pHex,培養(yǎng)基pH)使用pH微電極計(jì)(Unisense,Denmark)測(cè)量。

胞內(nèi)pH(pHi)使用pH敏感染料2',7'-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素乙酰氧基甲酯(2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester,BCECF-AM;Beyotime Institute of Biotechnology,江蘇,中國(guó))測(cè)量。本研究采用雙激發(fā)比率法，借助多掃描光譜儀(SpectraMax M5,CA,USA)進(jìn)行；激發(fā)波長(zhǎng)分別為440nm和488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm。使用離子載體尼日利亞菌素(nigericin;Sigma,Lezennes,France)和一組pH范圍從6.5到8.5的確定的高K?磷酸鹽緩沖液進(jìn)行體內(nèi)校準(zhǔn)(Corvini et al.,2000)。

2.5.DNA微陣列實(shí)驗(yàn)和微陣列數(shù)據(jù)分析

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Hidden,Germany)按照制造商的說明分離和純化總RNA，并使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent,CA,USA)檢查質(zhì)量和數(shù)量。使用Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color對(duì)總RNA進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。使用RNeasy Mini Kit純化Cy3標(biāo)記的cRNA。在Hybridization Oven中雜交17小時(shí)。雜交后，在Gene Expression Wash Buffer Kit中清洗載玻片，并使用Agilent Microarray Scanner G2565CA掃描微陣列。

使用Feature Extraction Software 10.7進(jìn)行陣列圖像的采集和量化，并使用Quantile算法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。計(jì)算每個(gè)基因的歸一化表達(dá)比率，并使用標(biāo)準(zhǔn)fold change

>2.0且p<.05進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（t檢驗(yàn)）中p值最低的變化值作為最可靠的值。為了用一個(gè)技術(shù)重復(fù)代表每種培養(yǎng)條件下三次測(cè)量的變異，計(jì)算了變異系數(shù)(CV)。在樣本中，至少98%的基因組產(chǎn)生了可檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄本，平均變異系數(shù)不超過0.15，符合Agilent的質(zhì)量控制建議。

2.6.通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)

使用Trizol(Invitrogen,CA,USA)提取總RNA，并用gDNA Eraser(Takara,大連,中國(guó))處理。隨后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara,大連,中國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus)(Takara,大連,中國(guó))在StepOne Real-Time PCR(Applied Biosystems)上測(cè)定基因的轉(zhuǎn)錄水平。PCR條件為：95°C預(yù)變性10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95°C變性15秒，58°C退火60秒，72°C延伸15秒。對(duì)于每個(gè)基因，將種子階段的發(fā)酵樣品定義為表達(dá)水平1.0，結(jié)果表示為mRNA水平相對(duì)于對(duì)照樣品的倍數(shù)增加(Feng et al.,2016)。

2.7.胞內(nèi)游離谷氨酸濃度的測(cè)定

使用HPLC采用茚三酮比色法測(cè)定在37°C(220 rpm)下培養(yǎng)兩天的菌株5008的胞內(nèi)游離谷氨酸。從發(fā)酵培養(yǎng)基中不同時(shí)間點(diǎn)抽取的生物量樣品在12,000g下離心5分鐘，洗滌兩次，重新懸浮在1 mL ddH2O中，并在冰浴中通過超聲破碎（20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)5秒超聲，間隔10秒）。通過9000g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片，然后將上清液與10%的水楊基磺酸(salicylsulfonic acid)混合，在-20°C下放置20分鐘，然后在12,000g下離心60分鐘分離。然后，將提取物蒸發(fā)，用1 mL 0.02 mol/L HCl重新懸浮，并用0.22μm水相濾膜過濾(Wu et al.,2012)。將20μL每個(gè)樣品注入HPLC進(jìn)行谷氨酸測(cè)量。

2.8.CTC染色

5-氰基-2,3-二苯基氯化四氮唑(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride,CTC)是一種可溶、不發(fā)熒光的染色劑。它可被呼吸細(xì)胞的電子傳遞鏈吸附并還原成不溶的紅色熒光物質(zhì)(CTC formazan)，并在細(xì)胞中積累。因此，這種氧化還原染料已被廣泛用于確定細(xì)菌的呼吸活性。熒光強(qiáng)度越高代表呼吸活性越高。通過12,000g離心5分鐘從搖瓶中收集菌絲體，洗滌兩次并重懸于生理鹽水(0.9%NaCl)中。使用Bacstain-CTC快速染色試劑盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)在1.5 mL離心管中按照說明書進(jìn)行CTC染色30分鐘(37°C)(Winding et al.,1994)。將200μL染色樣品置于96孔板中，使用Multiscan Spectrum(SpectraMax M5,CA,USA)在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和620 nm至640 nm發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。