3.結(jié)果與討論

3.1.pH沖擊對(duì)Val-A產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)的影響

經(jīng)過初步篩選pH，pH沖擊在8.0時(shí)效果最佳。分別向發(fā)酵液中添加三種常見的堿性溶液。發(fā)現(xiàn)兩種有效的添加劑氫氧化鈉和氨水，而磷酸鹽緩沖液則產(chǎn)生相反的效果(圖1a)。這與一些出版物一致，這些出版物記載過量的無機(jī)磷酸鹽通常會(huì)抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)(Sola et al.,2003)。因此，所得結(jié)果表明pH沖擊有利于Val-A的生產(chǎn)。氫氧化鈉組的Val-A產(chǎn)量最高，因此選擇氫氧化鈉進(jìn)行進(jìn)一步研究。關(guān)于pH沖擊的適宜時(shí)間，選擇4 h-24 h內(nèi)的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為最旺盛的時(shí)期(圖1b)。當(dāng)堿性沖擊時(shí)間晚于24小時(shí)時(shí)，該處理對(duì)Val-A產(chǎn)量沒有顯著影響，未在圖1b中顯示。很明顯，第20小時(shí)是進(jìn)行pH沖擊的最佳時(shí)間。在4 h-12 h添加氫氧化鈉時(shí)，細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)早期，堿性溶液的刺激在一定程度上阻礙了細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此pH沖擊沒有明顯效果甚至降低了Val-A的產(chǎn)量。至于不同的處理次數(shù)，發(fā)現(xiàn)多次pH沖擊的效果未達(dá)到預(yù)期(圖1c)。在Val-A合成過程中，發(fā)酵液的pH會(huì)持續(xù)上升，這使得多次pH沖擊的效果不如單次pH沖擊顯著。總之，最佳條件是在第20小時(shí)向發(fā)酵液中添加氫氧化鈉溶液，而過多的無機(jī)磷酸鹽對(duì)Val-A生產(chǎn)有阻礙作用。pH沖擊對(duì)吸水鏈霉菌S.hygroscopicus 5008的細(xì)胞重量有顯著影響，在96小時(shí)時(shí)從6.00 g/L增加到6.60 g/L(圖2)。

發(fā)酵24小時(shí)后，pH沖擊組的細(xì)胞積累量更高，pH沖擊組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率比對(duì)照組快。這一現(xiàn)象表明pH刺激了鏈霉菌的代謝，在一定程度上加速了其生長(zhǎng)，同時(shí)伴隨著Val-A的大量合成，增加了27.43%。在第四天，pH沖擊組的Val-A產(chǎn)量和產(chǎn)率(13.29 g/L;2.01 g/g蛋白)均高于對(duì)照組(10.78 g/L;1.80 g/g蛋白)(圖1c和圖2)。可以推測(cè)，在發(fā)酵早期積累了前體，然后這些前體被用來合成Val-A。Val-A產(chǎn)量的增加是生物量和產(chǎn)量增加的綜合效應(yīng)。糖的消耗反映了鏈霉菌的能量代謝。Val-A合成的碳源前體是磷酸戊糖途徑上的景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose 7-phosphate)(Degwert et al.,1987;Toyokuni et al.,1987)。pH沖擊組在第一天的糖消耗速率[2.23 g/(L·h)]快于對(duì)照組[1.91 g/(L·h)]，且pH沖擊組的細(xì)胞代謝活性相對(duì)較高(圖2)。這主要是由于堿性刺激，細(xì)胞加速利用碳水化合物產(chǎn)酸以恢復(fù)pH。此外，發(fā)酵液中糖的消耗為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了能量，這與生物量的增加相符。

3.2.S.Hygroscopicus 5008培養(yǎng)過程中的pH變化

在5008正常情況下，發(fā)酵液pH逐漸升高。在發(fā)酵前期，pH緩慢上升，然后快速上升直至達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定(圖3)。發(fā)酵液pH是微生物發(fā)酵的綜合結(jié)果。Val-A可以與氫離子結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)酵液中羥基離子比例上升(Bai et al.,2006)。因此，在發(fā)酵后期，當(dāng)Val-A大量合成時(shí)pH上升。在pH沖擊組中，菌絲體首先在自然條件下培養(yǎng)20小時(shí)，然后在pH 8.0進(jìn)行堿性pH沖擊。之后，pH在短時(shí)間內(nèi)迅速下降，這是由脅迫響應(yīng)引起的。最終，pH在60小時(shí)后恢復(fù)，進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。此外，Val-A在酸性條件下(pH<5.0)可被水解(Jin et al.,2006)，因此發(fā)酵pH的升高也有利于Val-A的積累和穩(wěn)定。

胞內(nèi)pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝至關(guān)重要，它可以影響營(yíng)養(yǎng)吸收和利用、蛋白質(zhì)合成、線粒體呼吸、碳水化合物代謝和其他重要的生命活動(dòng)(Cotter et al.,2001)。因此，只有保持胞內(nèi)pH的穩(wěn)定，才能確保微生物的正常生長(zhǎng)和代謝。如圖3所示，在整個(gè)發(fā)酵過程中，胞內(nèi)pH略有上升，從初始的7.21到最終的7.73。Corvini(Corvini et al.,2004)也使用BCECF-AM熒光探針測(cè)定普拉鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)的胞內(nèi)pH，范圍在6.5到8.5之間。還發(fā)現(xiàn)基因SHJG7463編碼的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶在DNA微陣列中高表達(dá)，表明陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)加速以中和pH的變化。此外，大量的ATP將被消耗以轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞膜內(nèi)外的氫離子，這也解釋了下面關(guān)于菌絲體呼吸活性的現(xiàn)象。此外，需要注意的是，三羧酸循環(huán)導(dǎo)致外部pH上升，而糖酵解和谷氨酸的合成通常導(dǎo)致酸化。因此，pH沖擊組中的pH波動(dòng)可能是碳水化合物快速消耗和氨基酸代謝的綜合結(jié)果。

3.3.pH沖擊誘導(dǎo)的基因表達(dá)全局變化

使用統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)Fold change大于2且p小于0.05，在菌株5008中鑒定出總共146個(gè)pH沖擊下的差異表達(dá)基因(DEGs)(表1)。在pH沖擊下顯著變化的DEGs主要分配了代謝、細(xì)胞過程和信號(hào)傳導(dǎo)以及信息存儲(chǔ)和處理相關(guān)的功能。正如預(yù)期的那樣，大多數(shù)Val-A生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平在pH沖擊下得到增強(qiáng)，除了葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG。

在與代謝相關(guān)的DEGs中，基因SHJG7463編碼細(xì)胞膜上的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。這些基因的上調(diào)表達(dá)表明鏈霉菌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以及時(shí)響應(yīng)pH沖擊，這有利于營(yíng)養(yǎng)吸收和次級(jí)代謝產(chǎn)物的排泄，并且相關(guān)的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與鏈霉菌發(fā)酵過程中的pH變化和呼吸鏈密切相關(guān)。編碼谷氨酰胺合成酶的SHJG3702上調(diào)。這與Gu的研究(Gu et al.,1984;Wei et al.,2012)一致，該研究表明谷氨酰胺和3-氨基-5-羥基苯甲酸(3-Amino-5-hydroxy benzoic acid)可顯著提高Val-A產(chǎn)量，并且谷氨酰胺合成酶活性與Val-A產(chǎn)量呈正相關(guān)。另一個(gè)DEG SHJG6704編碼銨透性酶(ammonium permease)。夏(Xia and Jiao,1986)發(fā)現(xiàn)添加銨離子可以通過加速氮代謝促進(jìn)Val-A合成過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)。SHJG6704的上調(diào)表達(dá)為Val-A提供了更多的氮源，并促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。SHJG0557編碼一種細(xì)胞色素bd型醌氧化酶(cytochrome bd-type quinol oxidase)。SHJG7814編碼一種糞卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase)和相關(guān)的Fe-S氧化還原酶。鐵硫氧化還原酶、細(xì)胞色素和鐵硫蛋白是細(xì)胞電子呼吸鏈的組成部分。SHJG0557和SHJG7814的上調(diào)表達(dá)意味著吸水鏈霉菌S.hygroscopicus 5008的呼吸發(fā)生了變化，這是pH沖擊的響應(yīng)措施之一。

在與細(xì)胞過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEGs中，編碼UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶(UDP-N-acetylmuramate dehydrogenase)的基因SHJG3272上調(diào)了2.99倍，而編碼細(xì)胞分裂蛋白FtsI/青霉素結(jié)合蛋白2(cell division protein FtsI/penicillin-binding protein 2)的基因SHJG3894和SHJG3896以及幾個(gè)細(xì)胞壁水解酶基因則下調(diào)。這些基因與細(xì)胞壁合成相關(guān)，表明在pH沖擊的影響下，細(xì)胞壁合成過程得到加強(qiáng)。

在與信息存儲(chǔ)和處理相關(guān)的DEGs中，大部分是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們?cè)诖渭?jí)代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控中發(fā)揮作用，也表明S.hygroscopicus 5008通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)響應(yīng)pH沖擊。原核生物的基因轉(zhuǎn)錄需要由核心酶和σ因子組成的RNA聚合酶。編碼RNA聚合酶ECF亞家族σ因子的基因SHJG6022顯著上調(diào)。在天藍(lán)色鏈霉菌中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)Cse B/Cse C影響σE(sigma E)的活性(Paget et al.,2002)。環(huán)境脅迫信號(hào)由雙組分系統(tǒng)傳導(dǎo)。該系統(tǒng)與σE的啟動(dòng)子結(jié)合，然后在核心酶的相互作用下激活轉(zhuǎn)錄。因此，推測(cè)雙組分系統(tǒng)和σE的相互作用也可能在S.hygroscopicus 5008中參與，可以傳遞pH脅迫信號(hào)并調(diào)控參與Val-A生物合成的基因的表達(dá)。

總之，這些DEGs主要與氨基酸代謝、細(xì)胞過程和信號(hào)傳導(dǎo)以及信息存儲(chǔ)和處理相關(guān)。此外，通過qRT-PCR分析驗(yàn)證了關(guān)鍵基因的動(dòng)態(tài)變化。在轉(zhuǎn)錄變化方面，DNA微陣列和qRT-PCR分析之間顯示出良好的一致性，表明了微陣列數(shù)據(jù)的可靠性。可以推測(cè)，在外源pH沖擊下，細(xì)胞壁接收的脅迫信號(hào)通過雙組分系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后由雙組分系統(tǒng)調(diào)控的ECFσ因子將與核心酶一起作用于下游基因并激活細(xì)胞防御系統(tǒng)。最終，營(yíng)養(yǎng)物和離子轉(zhuǎn)運(yùn)加速，導(dǎo)致葡萄糖代謝、氨基酸代謝、呼吸鏈和其他生理活動(dòng)的變化，同時(shí)也緩解了堿性刺激并促進(jìn)了Val-A的生物合成。

表1 pH沖擊后5008中的差異表達(dá)基因：使用COG進(jìn)行分類

3.4.Val-A發(fā)酵過程中呼吸活性的變化

如圖4所示，兩種策略下的菌絲體呼吸活性在接種后均下降，這可能歸因于程序性細(xì)胞死亡。36小時(shí)后，由于蛋白質(zhì)的快速合成和更多的細(xì)胞積累，pH沖擊組的呼吸活性持續(xù)增加了12小時(shí)，然后開始下降。微生物呼吸鏈成分的基礎(chǔ)是NAD、FAD、FAM、鐵硫蛋白(Fe-S)、泛醌(輔酶Q)和細(xì)胞色素系統(tǒng)。上調(diào)表達(dá)的基因SHJG0557編碼細(xì)胞色素BD氧化酶，SHJG7814編碼鐵硫氧化還原酶，這些酶是呼吸鏈的基本組成部分。可以推測(cè)，pH沖擊后呼吸電子傳遞鏈中的酶活性增強(qiáng)，因此電子傳遞和呼吸加速以產(chǎn)生更多能量，這對(duì)于Val-A合成至關(guān)重要。

3.5.pH沖擊對(duì)氮代謝的影響

先前的研究使用氮同位素標(biāo)記法報(bào)道，谷氨酸很可能是氮橋的主要來源(Mahmud et al.,1999)。根據(jù)Hodgson的報(bào)告(Hodgson,2000)和KEGG，S.hygroscopicus 5008的氮同化途徑如圖5所示。當(dāng)?shù)闯渥銜r(shí)，銨被谷氨酸脫氫酶催化成谷氨酸。當(dāng)缺乏氮源時(shí)，銨主要被谷氨酰胺合成酶(GS)催化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸。谷氨酰胺和谷氨酸都參與了Val-A生物合成的一系列反應(yīng)過程。微陣列和qRT-PCR的結(jié)果顯示，基因SHJG3702和SHJG6704均上調(diào)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)pH沖擊組胞內(nèi)谷氨酸濃度是對(duì)照組的2.82倍（圖5），這表明在pH沖擊下銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)加速，從而產(chǎn)生更多的谷氨酰胺和谷氨酸。顯然，細(xì)胞處于相對(duì)高氮的環(huán)境中，而Val-A合成正在進(jìn)行，因此更多的氮前體（谷氨酸）有利于Val-A的合成。此外，先前對(duì)一系列微生物的研究表明，輸入的肽可以被分解成游離氨基酸，形成重要的質(zhì)子來源(Giotis et al.,2010)。谷氨酸是酸性氨基酸，增加的谷氨酸除了提供氮源外，還可以緩解堿的壓力。

圖5.pH沖擊后5008的氮同化途徑和胞內(nèi)游離谷氨酸的變化。

4.結(jié)論

堿性pH沖擊使Val-A產(chǎn)量顯著提高了27.43%。結(jié)合DNA微陣列，研究了其對(duì)細(xì)胞呼吸活性和胞內(nèi)微環(huán)境的影響，揭示了鏈霉菌對(duì)pH沖擊的細(xì)胞響應(yīng)機(jī)制（圖6）。pH沖擊加速了質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)并增強(qiáng)了細(xì)胞的呼吸活性，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了更多能量。并且此過程中酸性氨基酸的形成為井岡霉素合成提供了更多的氮前體。因此，上述因素的共同作用提高了Val-A的產(chǎn)量。顯然，在鏈霉菌發(fā)酵中應(yīng)更加重視堿性pH沖擊。

致謝

本工作得到浙江省公益項(xiàng)目(2016C32007)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0401201)、浙江省科協(xié)青年人才培育項(xiàng)目(2016YCGC004)和國(guó)家自然科學(xué)基金(20906060)的資助。