結(jié)果：

1.瘧原蟲感染增加鼠傷寒沙門氏菌的腸道定植

在實(shí)驗(yàn)性瘧疾模型中，如約氏瘧原蟲(以下簡稱瘧原蟲)，感染小鼠可改變腸道環(huán)境，降低對鼠傷寒沙門氏菌的定植抵抗力。然而，在感染后的較晚時(shí)間點(diǎn)，鼠傷寒沙門氏菌可以克服定植耐藥性，因?yàn)樗亩玖σ蜃樱瑑煞NIII型分泌系統(tǒng)(T3SS-1和T3SS-2)，引發(fā)腸道炎癥。為了從鼠傷寒沙門氏菌毒力因子對減弱定殖力的貢獻(xiàn)中分離出并發(fā)瘧疾的貢獻(xiàn)，在接種瘧原蟲后的不同時(shí)間點(diǎn)，小鼠組被感染野生型鼠傷寒沙門氏菌或缺乏T3SS-1(由于invA突變)和T3SS-2(由于SpiB突變)的invASpiB突變體(如圖1A所示)。當(dāng)在瘧原蟲注射(DPP)后6天或更晚時(shí)，鼠傷寒沙門氏菌在感染瘧原蟲的小鼠的盲腸和結(jié)腸中定植的水平比對照小鼠高10到100倍(圖1B，1C，S1A)。這與鼠傷寒沙門氏菌的毒力無關(guān)，因?yàn)橐吧秃蚷nvA SpiB突變體都顯示出更強(qiáng)的定殖力(圖3)。6-dpp時(shí)間點(diǎn)與瘧原蟲在血液中擴(kuò)展的高峰期相關(guān)（圖S2A）。此時(shí)，感染瘧原蟲的小鼠已持續(xù)出現(xiàn)嚴(yán)重貧血（圖S2B），體重大幅下降（圖S2C），而脾臟腫大在整個(gè)瘧原蟲感染過程中持續(xù)增加（圖S2D）。因此，6天后瘧原蟲接種被確定為最早的可靠時(shí)間點(diǎn)，以研究瘧疾相關(guān)定植抗性缺陷的根本原因，并被用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)的主要模型。

2.硝酸鹽和氧氣相關(guān)生長對促進(jìn)鼠傷寒沙門氏菌定植的影響

由于瘧原蟲感染期間招募的巨噬細(xì)胞通過硝酸鹽呼吸作用促進(jìn)共生腸桿菌的生長，而且先前的工作表明，瘧原蟲感染也會(huì)招募巨噬細(xì)胞到盲腸粘膜，因此我們假設(shè)，同時(shí)發(fā)生的瘧疾可能會(huì)增加管腔內(nèi)硝酸鹽的供應(yīng)量，從而促進(jìn)傷寒桿菌的擴(kuò)增。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，我們用兩種菌株1:1的混合物感染小鼠，比較了鼠傷寒桿菌野生型與缺乏硝酸鹽還原酶活性的突變體（napA narG narZ cyxA突變體）的適應(yīng)性。盡管共同感染組小鼠的腸道負(fù)擔(dān)總體上有所增加，但硝酸鹽呼吸的基因消減并沒有降低傷寒桿菌在瘧原蟲感染小鼠中的適應(yīng)性（圖1D，E）。這一發(fā)現(xiàn)表明，在并發(fā)瘧疾期間，硝酸鹽的利用對于提高鼠傷寒桿菌的糞便恢復(fù)能力是不可或缺的。

另外，有研究表明，炎癥也會(huì)通過增加氧氣的生物利用率而使傷寒桿菌受益。通過傷寒桿菌毒力相關(guān)的炎癥或服用抗生素來消耗梭狀芽孢桿菌，會(huì)導(dǎo)致微生物群中短鏈脂肪酸（SCFA）丁酸鹽的產(chǎn)生減少，而這種脂肪酸通常會(huì)促進(jìn)負(fù)責(zé)維持管腔缺氧的結(jié)腸上皮細(xì)胞。丁酸鹽供應(yīng)量的減少會(huì)使結(jié)腸細(xì)胞的初級新陳代謝從氧氣密集型的SCFA分解轉(zhuǎn)向氧氣密集型的SCFA分解，從而增加氧氣向結(jié)腸腔的擴(kuò)散。這為沙門氏菌和大腸桿菌等使用細(xì)胞色素氧化酶的兼性厭氧菌的生長提供了額外的呼吸電子受體。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲感染會(huì)影響微生物群，包括糞便中的梭狀芽孢桿菌相對減少，我們推測這可能是打開了結(jié)腸中的氧氣呼吸生態(tài)位，促進(jìn)了沙門氏菌的生長。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，我們比較了鼠傷寒沙門氏菌野生型與缺乏高親和力細(xì)胞色素bd氧化酶的突變體（cydA突變體）的適應(yīng)性。然而，盡管cydA在受瘧原蟲感染的小鼠中提供了約10倍的體能優(yōu)勢，但在未暴露于瘧原蟲的小鼠中也觀察到了類似的體能優(yōu)勢（圖1F，G），這表明共同感染小鼠腸腔內(nèi)氧的增加并沒有導(dǎo)致鼠傷寒桿菌水平的升高。總體而言，這些結(jié)果表明，增加對呼吸電子受體的可及性是不是瘧原蟲感染期間定植抗性缺陷的主要促成因素。

3.瘧原蟲感染不會(huì)迅速增加腸道內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌的復(fù)制

瘧原蟲沒有增強(qiáng)呼吸道生長缺陷，這讓我們產(chǎn)生了疑問：在共同感染的小鼠中，定植抗性的降低是否與鼠傷寒桿菌的快速生長有關(guān)？為了評估這個(gè)問題，我們給小鼠接種了攜帶乳糖抑制質(zhì)粒pAM34的鼠傷寒桿菌，該質(zhì)粒可用于短期評估細(xì)菌在低乳糖環(huán)境（如成年小鼠腸道）中的生長情況。挑戰(zhàn)24小時(shí)后，盡管共感染小鼠組的細(xì)菌定植量增加，但整個(gè)腸道的鼠傷寒沙門氏菌種群在瘧原蟲聯(lián)合感染和模型感染的小鼠中顯示出相同的復(fù)制率（圖2A，B）。耐人尋味的是，我們發(fā)現(xiàn)共感染小鼠在受到挑戰(zhàn)4小時(shí)后的傷寒桿菌定植率已經(jīng)更高，這也與體內(nèi)生長速度無關(guān)（圖2C，D）。鼠傷寒沙門氏菌感染量的這種快速差異并沒有伴隨著復(fù)制的增加，這表明細(xì)菌的快速生長并不是造成瘧原蟲感染小鼠定植增強(qiáng)的原因。

4.約氏瘧原蟲感染影響胃的抗菌防御

由于小鼠接種瘧原蟲后，傷寒桿菌載量的差異很快就出現(xiàn)了，因此我們推測，瘧原蟲感染可能會(huì)損害了固有的對細(xì)菌定植的“瓶頸”防御，這種防御在病原體攝入后期起作用。我們還觀察到，合并感染的小鼠在整個(gè)上消化道中往往表現(xiàn)出較高的鼠傷寒桿菌水平（圖S3A），看來合并感染的小鼠對鼠傷寒桿菌定植抵抗力的喪失可能發(fā)生在胃或小腸中。

胃中的高酸性（pH值為1.5至3）環(huán)境是許多腸道病原體定植最嚴(yán)重的初始瓶頸之一。盡管鼠傷寒沙門氏菌在中性pH下生長旺盛，但在體外短期（60分鐘）暴露于低至pH4的酸性環(huán)境中也能存活（圖3A）。然而，接種的細(xì)菌在pH值為3.5或更低時(shí)迅速死亡，暴露于pH值為2.5或更低的培養(yǎng)基中的細(xì)菌無一存活（圖3A）。包括致病性和非致病性在內(nèi)的許多腸桿菌都具有類似程度的酸敏感性（圖S4，A至E）。這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果相吻合，表明傷寒桿菌和其他腸道病原體極易被胃中的酸性物質(zhì)殺死。因此，胃酸維持不足可能導(dǎo)致攝入的鼠傷寒桿菌在腸道中存活率更高。

當(dāng)使用pH感應(yīng)微電極直接測量胃腔酸度時(shí)，與模擬感染小鼠（平均pH=2.46±0.32）相比，到6dpp時(shí)瘧原蟲感染與胃pH顯著升高（平均pH=4.02±1.07）相關(guān)（圖3B）。在感染瘧原蟲期間出現(xiàn)的低鹽血癥與定植抵抗力的喪失有關(guān)，因?yàn)樵?dpp之前的小鼠中檢測不到低鹽血癥（圖S3B）。6dpp小鼠的胃普遍小于模擬感染對照組（圖S5A），部分原因可能是進(jìn)食量減少（圖S5B），這與觀察到的寄生蟲感染期間體重下降模式一致（圖S2C）。由于進(jìn)食可刺激胃酸分泌，我們預(yù)測觀察到的pH值差異是瘧疾期間進(jìn)食量急劇減少的結(jié)果。禁食模擬感染小鼠一夜足以減輕胃重量（圖S5C），但與自由進(jìn)食的喂養(yǎng)小鼠相比，禁食小鼠的胃pH值并沒有改變（圖S5D）。禁食也不能使禁食的模擬小鼠和感染了瘧原蟲的小鼠對接種的鼠傷寒桿菌的定植抗性恢復(fù)正常（圖S5E），這表明在瘧原蟲感染期間，胃酸度和對鼠傷寒桿菌定植的易感性的缺陷不僅僅是食物攝入量的急劇下降。

5.瘧疾引起的胃酸降低影響鼠傷寒沙門氏菌的定植

我們接下來想確定所觀察到的低鹽酸血癥是否真的是合并感染的傷寒桿菌存活率增加的原因。胃酸分泌通常是通過對胃頂細(xì)胞的刺激信號(hào)和抑制信號(hào)相結(jié)合來調(diào)節(jié)的，從而導(dǎo)致胃質(zhì)子泵轉(zhuǎn)位到頂端膜并向胃腔主動(dòng)分泌胃酸。最有效的分泌信號(hào)之一是組胺，它由胃腺中的腸石蠟樣細(xì)胞在局部釋放，與胃頂細(xì)胞的H2受體（H2R）結(jié)合。為了評估在感染瘧原蟲期間胃的高pH值是否是導(dǎo)致定植抵抗力缺陷的原因，在小鼠挑戰(zhàn)鼠傷寒沙門氏菌前1小時(shí)用特異性H2R激動(dòng)劑二鹽酸地馬普利特刺激胃酸分泌。給予H2R激動(dòng)劑可使感染瘧原蟲的動(dòng)物的胃pH值迅速降至模擬感染水平（圖3C）。此外，在瘧原蟲感染的小鼠中，H2R刺激挽救了對鼠傷寒沙門氏菌的定植抗性（圖3D，E），而不影響寄生蟲感染，包括寄生蟲血癥（圖S6A）和貧血（圖S6B）。

在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，用質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑治療小鼠，以阻止胃酸分泌到胃腔，然后再進(jìn)行鼠傷寒桿菌挑戰(zhàn)。對照組小鼠接受奧美拉唑治療后，胃pH值（圖3F）和鼠傷寒桿菌定植（圖3G和H）相對于接受藥物治療的小鼠都有所上升，這與之前觀察到的結(jié)果相同。然而，與給予載體的瘧原蟲感染小鼠相比，給予奧美拉唑并不會(huì)進(jìn)一步增加鼠傷寒桿菌的定植（圖3G，H），也不會(huì)影響寄生蟲感染的嚴(yán)重程度（圖S6，C和D）。這表明，僅感染瘧原蟲對胃pH值的影響就足以最大限度地幫助接種細(xì)菌更好地在胃環(huán)境中生存。總之，這些數(shù)據(jù)表明，感染瘧原蟲的小鼠胃酸減少是導(dǎo)致其對傷寒桿菌感染易感性增加的原因，因?yàn)榧纳x相關(guān)的低鹽血癥是促進(jìn)胃內(nèi)接種細(xì)菌存活的必要條件，而胃酸減少反過來又會(huì)促進(jìn)腸道定植。