2.材料與方法

2.1光生物反應(yīng)器的啟動(dòng)和運(yùn)行

為了評(píng)價(jià)在ABA系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行吡啶生物降解和脫氮的可行性，我們采用了兩個(gè)由工作體積為2.5L、高徑比為3的有機(jī)玻璃制成的管狀連續(xù)流光生物反應(yīng)器（PBRs），平行運(yùn)行75天，PBRs的構(gòu)型如圖S1所示。LED燈安裝在PBRs周圍，以提供密度為180μmol·m-2·s-1的光，每12小時(shí)開或關(guān)一次燈。反應(yīng)器運(yùn)行溫度保持在25±2℃。在水力保留時(shí)間（HRT）下，將合成廢水泵入兩個(gè)PBRs。其中一個(gè)PBRs由預(yù)培養(yǎng)的藻-菌群接種，以PBR-0命名，而PBR-1由藻-菌群和來自城市污水處理廠（中國(guó)南京）的活性污泥接種。以副球菌（Paracoccus sp.NJUST47）和小球藻（Chlorella sorokiniana FACHB-275）為接種物，預(yù)培養(yǎng)48 h。副球菌為吡啶降解菌，小球藻為典型藻類。將小球藻和副球菌分別接種到PBRs中，細(xì)胞密度分別為（4.17±1.24）×106 cell·mL?1和（6.55±3.18）×106 CFU·mL?1。將活性污泥接種到PBR-1中，混合液懸浮物（MLSS）濃度為1000 mg·L?1。

合成廢水的制備方法如下：磷酸鹽緩沖液（7 mM），CaCl2·2 H2O(0.036g·L?1),MgCl2·6H2O(0.16g·L?1),碳酸鈉(0.02g·L?1)、EDTA(1mg·L?1)和微量元素溶液(1mL·L?1).磷酸二氫鉀和12水磷酸氫二鈉作為磷酸鹽緩沖液，控制pH7.2±0.1。微量元素溶液中含有硼酸(2.86g·L?1),4水氯化錳(1.81g·L?1),7水硫酸鋅(0.222g·L?1),5水硫酸銅(0.079g·L?1),NaMoO4.2H2O(0.390g·L?1)，Co(NO3)2·6 H2O(0.0494g·L?1)。150mg·L?1吡啶作為唯一的有機(jī)碳和氮源加入到合成廢水中，是真實(shí)廢水中的典型濃度。相應(yīng)地，吡啶和氮的負(fù)載速率為75g·m-3·d·L?1和13.3g·m-3·d·L?1，C/N比為4.3。

2.2分批式反應(yīng)器和PBRs的操作

根據(jù)之前的研究，在PBR-1操作過程中進(jìn)行了非原位分批實(shí)驗(yàn)，研究了光照強(qiáng)度、額外的碳源和額外的硝酸鹽對(duì)吡啶和氮去除的影響。分批反應(yīng)器由相同的200mL玻璃血清瓶建立，用帶有橡膠隔膜的鋁卷曲蓋密封，并以100rpm和25±2℃的條件放置在振動(dòng)臺(tái)上。以PBR-1中提取的ABA生物量進(jìn)行分批試驗(yàn)接種。對(duì)于如表S1所示的分批實(shí)驗(yàn)的操作條件，如果沒有特別說明的話，在合成廢水中加入濃度為150mg·L?1的吡啶，光強(qiáng)設(shè)置為90μmol·m-2·s-1。為了確認(rèn)硝化作用在ABA體系中的作用，在50 mg·L?1烯丙基硫脲（ATU）存在下評(píng)估了吡啶和脫氮性能，該烯丙基硫脲（ATU）經(jīng)常使用作為硝化抑制劑。為了驗(yàn)證反硝化作用，以吡啶/硝酸鹽摩爾比為0.5的硝酸鹽作為電子受體加入。為了研究光密度的影響，間歇式反應(yīng)器使用LED照明裝置在90、180和270μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)度下運(yùn)行。為了研究外部碳源的影響，根據(jù)完全反硝化，以1.9 mM的化學(xué)計(jì)量法加入醋酸鹽，C/N比為6.0。

2.3顯微分析

為了進(jìn)行熒光原位雜交（FISH）分析，在第75天從PBR-1中提取ABA樣品，用薄刀片將ABA切割成橫截面。此后，根據(jù)Lukumbuzya等人的方法制備樣品。使用以下探針：由TAMRA標(biāo)記的NSO190，對(duì)氨氧化β變形菌特異性；Ntspa662用VIC標(biāo)記，靶向所有硝基螺旋菌；PAR1457由太平洋藍(lán)標(biāo)記，用于識(shí)別反硝化菌；和覆蓋大多數(shù)細(xì)菌的Cy5標(biāo)記的EUB338。藻類可以通過葉綠素的熒光來觀察。使用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）（A1 HD25-TI2-U，Nikon，Japan）觀察熒光。此外，使用微電極自動(dòng)化系統(tǒng)（PA2000，Unisense，Denmark）測(cè)量光相期間ABA內(nèi)的DO和pH分布。

2.4元轉(zhuǎn)錄組學(xué)和酶活性分析

在第75天從PBR-1和PBR0中提取藻類-細(xì)菌污泥樣本，以進(jìn)行元轉(zhuǎn)錄組學(xué)和酶活性分析。元轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝和分析在中國(guó)馬約比奧-上海進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說，使用E。Z.N.A.®土壤RNAMidi試劑盒(OmegaBio-tek，諾克羅斯，GA，US.)，根據(jù)制造商的協(xié)議。用NanoDrop2000(賽默飛雪科學(xué)公司，US.).根據(jù)制造商的說明，使用核糖體零磁性試劑盒對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行rRNA去除程序。使用TruSeq?RNA樣本制備試劑盒（Illumina）構(gòu)建cDNA文庫。根據(jù)制造商的說明，在有限公司Majorbio Bio-Pharm技術(shù)有限公司的Illumina Hiseq 2500平臺(tái)上，使用Hiseq 4000 PE Cluster Kit和Hiseq 4000SBS Kit對(duì)條形碼庫進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序。每個(gè)樣本的開放閱讀框（ORFs）都使用轉(zhuǎn)基因掃描進(jìn)行預(yù)測(cè)。所有利用CD-HIT技術(shù)將序列一致性為95%（覆蓋率為90%）的序列聚類為非冗余基因目錄。將質(zhì)量控制后的Reads定位到具有95%同源性的代表性基因上，并使用RSEM評(píng)估FPKM。采用BLASTP進(jìn)行非冗余基因注釋，將非冗余基因目錄與NCBINR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)齊，e值截止值為1e?5.使用BLASTP對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG注釋。此外，通過在UniProtKB上搜索輔助基因調(diào)控因子、群體感應(yīng)（QS）和自誘導(dǎo)器等關(guān)鍵詞，建立了本地QS數(shù)據(jù)庫。

氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化酶（HAO）這兩種關(guān)鍵硝化酶，以及硝酸還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）、一氧化氮還原酶（NOR）和一氧化二氮還原酶（N2OR）這四種反硝化酶的活性，使用相應(yīng)的硝化和反硝化酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海景康生物工程有限公司，中國(guó)）進(jìn)行分析。

2.5分析方法

在分析前，所有的水樣在采樣后立即通過0.22μm的膜進(jìn)行過濾。采用高效液相色譜法（HPLC，e2695，Waters）對(duì)吡啶進(jìn)行了鑒定和定量。溶解有機(jī)碳（DOC）濃度用TOC分析儀（VARIOTOC，元素，德國(guó)）測(cè)量。NH4+-N是采用奈斯勒試劑比色法進(jìn)行分析。分別采用N-（1-萘）鹽酸乙二胺分光光度法和2-異丙基-5-甲基酚分光光度法測(cè)定NO2--N和NO3--N。采用Hach試劑的過硫酸鹽氧化分光光度法測(cè)定TN。采用HPLC/MS技術(shù)鑒定吡啶生物降解中間體，并配備ABSCIEXTrapleTOF5600+HPLC系統(tǒng)、離子阱質(zhì)譜儀和電噴霧電離源。生成的氣體混合物通過氣相色譜與FID和TCD探測(cè)器進(jìn)行氣相色譜（GC-2014C，日本）進(jìn)行分析。總氮（TN）包括液體中的氮（TNLiquor）和生物量中的氮(TNBio)。硝化-反硝化對(duì)TN的去除可以根據(jù)TNinitial和TNfinal之間的差異來評(píng)估。液體中的氮（TNLiquor）的去除可歸因于同化和硝化反硝化對(duì)TN的去除。同化法對(duì)TN的去除可以根據(jù)液體中的氮（TNLiquor）去除和硝化反硝化法對(duì)TN去除的差異來計(jì)算。根據(jù)進(jìn)水TNLiquor（吡啶-N）和出水TNLiquor（吡啶氮、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的總和）的差異計(jì)算TNLiquor的去除率總N計(jì)算清液量基于進(jìn)水的差異TNLivul（吡啶氮）和廢水TNLivul（吡啶氮、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的總和）。

硝化反硝化對(duì)TNLiquor的去除貢獻(xiàn)可以通過以下方程進(jìn)行評(píng)估：

通過同化去除TN對(duì)TNLiquor去除的貢獻(xiàn)可以通過以下方程進(jìn)行評(píng)估：