2.7質(zhì)譜儀設(shè)置

質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap Velos Pro采用正離子模式。在Orbitrap中進(jìn)行單次質(zhì)譜掃描，記錄350至1650m/z之間的質(zhì)量窗口，最大離子注入時(shí)間為250毫秒。分辨率設(shè)置為60，000，自動(dòng)增益控制設(shè)置為1，000，000離子。啟用鎖定質(zhì)量選項(xiàng)后，可通過聚二甲基環(huán)硅氧烷背景離子(質(zhì)子化(Si(CH3)2O))6；m/z 445.120025)對Orbitrap中記錄的光譜進(jìn)行內(nèi)部重新校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)采用數(shù)據(jù)依賴采集模式，交替進(jìn)行MS和MS/MS實(shí)驗(yàn)。觸發(fā)MS/MS的最小MS信號(hào)設(shè)定為500個(gè)離子，使用2 Da的隔離窗口選擇最突出的離子信號(hào)進(jìn)行MS/MS。已被選中用于MS/MS的信號(hào)的m/z值被置于排除列表中60秒，排除窗口大小為±10ppm。在所有情況下，記錄一次微掃描。線性離子阱中的CID目標(biāo)值為5000個(gè)離子，最大離子注入時(shí)間為150毫秒，歸一化碰撞能量為35%，Q值為0.25，激活時(shí)間為10毫秒。每次MS掃描最多觸發(fā)20次MS/MS實(shí)驗(yàn)。

2.8數(shù)據(jù)分析

使用Thermo Scientific Proteome Discoverer軟件1.3版處理原始MS文件。利用MASCOT和SEQUEST搜索引擎對包含正向和反向蛋白質(zhì)序列的Uniprot人類數(shù)據(jù)庫中的峰列表文件進(jìn)行搜索。使用Percolator對搜索到的肽段進(jìn)行過濾，使其FDR不超過1%，肽段質(zhì)量偏差設(shè)置為10ppm，并且要求每個(gè)識(shí)別出的肽段至少包含6個(gè)氨基酸。數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)為前體質(zhì)量容差20ppm，片段質(zhì)量容差CID 0.8 Da，動(dòng)態(tài)修飾為脫氨基(N、Q)、氧化(M)，靜態(tài)修飾為IAM烷基化(C)。在所有搜索中，都選擇了胰蛋白酶進(jìn)行兩次漏切。蛋白質(zhì)的分組采用了最大解析規(guī)則。用于確定蛋白質(zhì)絕對定量的計(jì)算方法是取含量最高的三個(gè)肽段的平均值。

2.9統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析

導(dǎo)出蛋白質(zhì)特征和定量數(shù)據(jù)，用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)和生物信息分析。每個(gè)無標(biāo)簽定量數(shù)據(jù)都按相應(yīng)的尿量進(jìn)行劃分，并采用量化法進(jìn)行歸一化處理。歸一化后，使用主成分分析(PCA)和斯皮爾曼相關(guān)性等無監(jiān)督分層聚類分析來識(shí)別離群值和樣本相似性。采用非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗(yàn)法檢測外泌體和尿瘤樣本之間的差異表達(dá)蛋白。使用本杰明-霍奇伯格假發(fā)現(xiàn)率(Benjamini-Hochberg false discovery rate)對P值進(jìn)行多重檢驗(yàn)調(diào)整。如果調(diào)整后的P值為0.05，且fold change<-2或>2，則認(rèn)為蛋白質(zhì)在兩種情況下有顯著差異表達(dá)。此外，蛋白質(zhì)必須在兩個(gè)隊(duì)列中至少有50%的樣本中被發(fā)現(xiàn)。火山圖用于快速顯示統(tǒng)計(jì)差異。不同樣本蛋白質(zhì)組的分層聚類分析結(jié)果通過熱圖的平均值顯示。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件包進(jìn)行。

Cytoscape軟件用于基因本體和通路分析。根據(jù)從UniProt數(shù)據(jù)庫中提取的基因本體注釋，提交了外泌體和尿瘤間差異富集蛋白的統(tǒng)計(jì)列表，以確定外泌體囊泡中生物過程的富集情況。

2.10耗氧量和ATP合成測量

氧氣消耗量是在配備有安培電極的恒溫氧儀(Unisense微呼吸系統(tǒng)，UnisenseA/S，丹麥)上測定的。每次實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基平衡電極，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)基包含120mM KCl、2mM MgCl2、1mM KH2PO4、50mM Tris-HCl、pH7.4和25μg/mL氨芐西林(最終體積1.7mL，溫度23℃)。呼吸速率以nmol O/min/mg表示。

ATP合成采用熒光素/熒光素酶化學(xué)發(fā)光法測定，如報(bào)告所述。簡而言之：樣品首先在37℃下孵育10分鐘：100mM Tris/HCl(pH7.4)、100mM KCl、1mM EGTA、2.5mM EDTA、5mM MgCl2、0.2mM二(腺苷-5′)五磷酸鹽、0.6mM歐貝因、氨芐青霉素(25μg/mL)、5mM KH2PO4。為誘導(dǎo)ATP合成，在相同pH值的混合物中加入0.1mM ADP。然后用熒光素/熒光素酶化學(xué)發(fā)光法在發(fā)光儀中測量ATP濃度，ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液在10-9和10-5M之間，用于校準(zhǔn)。為了刺激由復(fù)合物I+III+IV組成的通路，氧消耗和ATP合成分析均使用了0.7mM NADH。為了刺激由復(fù)合物II+III+IV組成的途徑，使用了20mM丁二酸。

3結(jié)果

圖1分離的外泌體的特征。圖A：分離的尿液外泌體的代表性透射電子顯微鏡圖像。圖B：通過動(dòng)態(tài)光散射評估的外泌體大小分布圖。該圖顯示了一個(gè)高斯分布曲線，平均峰值為80±8nm。

從6名男性和6名女性健康供體的第二次晨尿樣本中獲取外泌體和尿瘤。外泌體通過超速離心法分離。為確定其大小和形態(tài)，進(jìn)行了透射電子顯微鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射分析。圖1A顯示，超速離心得到的餾分由顯示典型外泌體杯狀形態(tài)的囊泡組成。通過動(dòng)態(tài)光散射分析確定了囊泡的大小，結(jié)果顯示囊泡呈高斯分布，平均峰值為80±8nm(圖1B)。

采用兩種不同的方法對獲得的樣本進(jìn)行尿瘤特征測定。第一種方法是凍干100微克的等分樣品，然后送去質(zhì)譜分析(未經(jīng)處理的部分)。第二種方法是在質(zhì)譜分析之前，用有機(jī)溶劑處理相同數(shù)量的樣品(100微克)，以富集疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)(沉淀部分)，并用組合肽配體庫珠子(CPLLbs)處理親水相，以富集低豐度蛋白質(zhì)(珠子和未結(jié)合部分)。

圖2維恩圖。A：外泌體和尿液中總蛋白質(zhì)的維恩圖；B：文獻(xiàn)和我們的數(shù)據(jù)以及健康供體尿瘤中外泌體數(shù)據(jù)的維恩圖，顯示常見和不常見的蛋白質(zhì)。數(shù)字代表各自重疊和非重疊區(qū)域中的不同蛋白質(zhì)。

在外泌體、未處理、沉淀、珠子和未結(jié)合餾分中分別鑒定出1951、1176、993、1614和1347個(gè)蛋白質(zhì)。各部分鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量相似。在尿瘤(共2469個(gè)蛋白質(zhì))中，珠狀體(14%)、未結(jié)合(14%)和沉淀(3%)部分分別鑒定出354個(gè)獨(dú)有蛋白質(zhì)、345個(gè)獨(dú)有蛋白質(zhì)和85個(gè)獨(dú)有蛋白質(zhì)。相比之下，未經(jīng)處理的樣品中只發(fā)現(xiàn)了154個(gè)專屬蛋白質(zhì)(6%)。這證實(shí)了在質(zhì)譜分析前進(jìn)行樣品分餾的優(yōu)勢，可以在蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)范圍較大的生物樣品中鑒定出大量蛋白質(zhì)。圖2A顯示了健康供體的外泌體和尿瘤蛋白質(zhì)之間的重疊程度。共有3429個(gè)蛋白質(zhì)存在，其中只有992個(gè)(29%)與外泌體和尿瘤相匹配。外泌體中的其余959個(gè)蛋白質(zhì)(28%)和尿瘤中的1478個(gè)蛋白質(zhì)(43%)不屬于這兩組中的一組。

12個(gè)生物重復(fù)序列的平均變異系數(shù)為0.5，各個(gè)蛋白質(zhì)組之間沒有發(fā)現(xiàn)任何關(guān)系。例如，它們沒有因性別而聚類。此外，通過使用DellR.B報(bào)告的公式，我們可以得出結(jié)論：12個(gè)生物重復(fù)樣本足以鑒定出兩倍變化的定量蛋白質(zhì)變異特征，顯著性水平為0.05，功率為80%。

圖3與外泌體和不同尿液組分的無監(jiān)督分層聚類分析相關(guān)的主成分分析和斯皮爾曼相關(guān)圖。樣本來自21名健康捐獻(xiàn)者。A，外泌體(圓圈)和尿液組分主成分分析的二維散點(diǎn)圖，即：未處理(上三角)、沉淀(下三角)、珠子(正方形)和未結(jié)合(點(diǎn))。B，斯皮爾曼相關(guān)圖：系數(shù)值用從0.1(藍(lán)色)到0.9(紅色)的偽彩色標(biāo)尺表示。此外，樹狀樹枝圖顯示了無監(jiān)督分層聚類分析的結(jié)果，將相似的斯皮爾曼系數(shù)值相互靠近。兩幅圖都顯示了外泌體和尿瘤之間兩個(gè)明顯的獨(dú)立聚類。

對不同的尿液組分和外泌體進(jìn)行了主成分和層次聚類分析，以突出兩組樣本的異同。外泌體和其他尿液組分的主成分二維散點(diǎn)圖顯示，在所有樣本中，外泌體和尿瘤的蛋白質(zhì)都有很好的分離(圖3A)。根據(jù)蛋白質(zhì)組的豐度特征，使用與分層聚類分析相關(guān)的斯皮爾曼相關(guān)圖也得到了相同的結(jié)果(圖3B)。此外，不同尿液組分的平均斯皮爾曼系數(shù)(R2)(0.74±0.11)高于外泌體和尿液組分之間的平均斯皮爾曼系數(shù)(0.26±0.08)。這證實(shí)外泌體和尿瘤組是兩個(gè)獨(dú)立的群組。

圖4外泌體和尿瘤分層聚類分析的火山圖和熱圖。A，根據(jù)外泌體和尿瘤中所有已鑒定蛋白質(zhì)的折疊變化(Log2)和P值(-Log10)繪制的火山圖。白色圓圈表示外泌體和尿瘤中發(fā)生顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)變化的1660個(gè)蛋白質(zhì)。共有1464個(gè)蛋白質(zhì)在外泌體中富集(右側(cè))，而196個(gè)蛋白質(zhì)在外泌體中代表性不足(左側(cè))。P值為>0.05的蛋白質(zhì)顯示為黑點(diǎn)。B，基于細(xì)胞組分基因本體注釋的外泌體和不同尿液組分蛋白質(zhì)組的無監(jiān)督二維分層聚類熱圖。在熱圖中，每一行代表一種蛋白質(zhì)，每一列對應(yīng)每組12個(gè)樣本的平均值。與每個(gè)蛋白質(zhì)的平均值相比，蛋白質(zhì)豐度的歸一化Z評分用偽彩色標(biāo)度表示，正表達(dá)(紅色)、等表達(dá)(白色)和負(fù)表達(dá)(藍(lán)色)。樹狀樹枝圖顯示了無監(jiān)督分層聚類分析的結(jié)果，將相似的蛋白質(zhì)組特征值相互靠近。對樹枝圖和熱圖的目視檢查表明，外泌體和尿瘤組有明顯的聚類。

為了更好地描述這兩組之間的差異，我們根據(jù)細(xì)胞成分基因本體注釋，對蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行了火山圖和熱圖分層聚類分析。火山圖顯示，與尿瘤相比，外泌體中共有1660個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化。其中，1464個(gè)蛋白質(zhì)在外泌體中富集(圖4A)。蛋白質(zhì)組譜熱圖顯示，細(xì)胞質(zhì)(34%)和細(xì)胞膜(21%)區(qū)明顯富集的蛋白質(zhì)占多數(shù)，而核區(qū)(13%)，特別是細(xì)胞外區(qū)(1%)與蛋白質(zhì)組總量相比代表性不足。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝和呼吸鏈等代謝途徑的蛋白質(zhì)含量明顯增加。特別是最后兩種途徑，在這里首次得到了強(qiáng)調(diào)。