分級正常氧高碳酸血癥期間的pHbrain變化

進行這些實驗是為了評估呼吸成分對PA期間記錄的pHbrain變化的貢獻。吸入CO?逐步增加5%（圖5A）導致pHbrain成比例地逐步降低（圖5B和5C）。動脈血氣分析顯示pHa類似的分級降低，因此在高碳酸血癥期間pHbrain和pHa之間的差異保持不變（圖5B）。在吸入20%CO?期間觀察到最大變化，此時pHa從7.52±0.06下降至6.98±0.02，而pHbrain從7.32±0.01下降至6.77±0.02。通過恢復正常碳酸血癥，pHbrain和pHa的變化完全逆轉。

討論

在本研究中，我們在一個轉化性仔豬PA/HIE模型中展示了PA期間和HIE亞急性期體內實時記錄的pHbrain值。本研究的主要發現如下：（1）我們的實驗模型引發了反映其主要特征的PA，并通過神經病理學揭示了對應于中度/重度HIE的神經元損傷；（2）腦皮質pHbrain對PA的反應急劇下降，大腦中的酸中毒比動脈血超過一個pH單位；（3）復蘇/再氧合使pHbrain恢復至基線水平，隨后pHbrain在基線水平附近保持穩定，在24小時觀察期內未發生重大偏移。

每個使用產后動物的PA/HIE模型都不可避免地帶有局限性，即PA是在適應宮外生活的心肺適應之后而非之前/期間誘導的。然而，我們相信在本研究中，通過兩個因素將這種劣勢降至最低。首先，我們使用真正的新生豬，因此它們對PA的脆弱性不太可能因產后發育而發生顯著改變。其次，我們引發的PA導致了足夠嚴重的動脈pH和血氣改變，這些已知預示著人類HIE的發展。這一說法有臨床研究支持，該研究報告了出現與未出現HIE的窒息嬰兒在酸中毒程度（pHa:6.75±0.18 vs 6.90±0.18）和高碳酸血癥程度（PaCO?:141±37 vs PaCO?:94±22 mmHg）上的顯著差異。在我們的模型中，相應值為pHa:6.79±0.02和PaCO?:160±6 mmHg，與人類HIE患者組的數據非常接近。有趣的是，在分娩期間經歷自發性PA的仔豬的臍動脈血樣本中獲得了幾乎相同的值（pHa:6.69±0.04和PaCO?:156±4 mmHg），也表明仔豬作為PA/HIE模型物種的轉化價值。我們開發并使用該PA/HIE方案來測試分子氫推定的神經保護作用。我們在本研究中報告了與之前使用該PA/HIE模型在窒息后24小時的新皮質、海馬和皮質下神經元損傷幾乎相同。基于相似的神經病理學發現，我們可以假設與pHbrain測量相關的手術操作未影響本研究中HIE的發展，支持當前pHbrain發現的轉化價值。

pHbrain在決定缺氧缺血應激后神經結局的重要性早已被認識。然而，關于仔豬PA/HIE模型中/后pHbrain變化的定量數據在文獻中非常稀少。Bender等人使用類似技術評估了1-3日齡仔豬的pHbrain。PA也使用低氧高碳酸血癥氣體混合物（5-8%O?-7%CO?）誘導30分鐘。在PA結束時，測得的pHbrain為6.26±0.14，比我們的研究高約0.3個pH單位，可能至少部分是由于PaCO?值低得多（61±1 vs.160±6 mmHg）。PA后，開始用100%O?通氣復蘇，此外，靜脈輸注碳酸氫鈉（2 mEq/kg）以快速糾正動脈pH。Bender等人研究中的這兩種干預措施都可能降低其轉化價值，因為它們未包含在當前的新生兒護理指南中，并且可能影響了pHbrain的恢復，該恢復在90分鐘內完成。此外，與假手術動物相比，除PA與出血性低血壓結合的實驗外，無顯著神經元損傷，表明所應用的PA本身嚴重程度不足以引發HIE。Corbett等人在8±3日齡仔豬中使用MRS測定缺血期間和之后的pHi，但非真正的PA。通過結合雙側頸動脈閉塞和出血性低血壓25分鐘，隨后再灌注90分鐘，引發不完全性腦缺血。缺血期間發生嚴重酸中毒，其嚴重程度取決于應激期間的血糖水平。在喂食仔豬中，腦pHi降至5.6以下，這些仔豬對缺血反應為高血糖（9.4-15 mmol/L），而在禁食仔豬中，對缺血反應為低血糖（1.4-2.6 mmol/L），缺血結束時的最低點僅為pHi≥6.6。再灌注后，pHi在90分鐘觀察期內再次正常化。

從上述討論的研究可以清楚地看出，更高水平的高碳酸血癥、腦血流和血糖都會促進PA期間腦酸中毒的發展。在人類和仔豬PA中觀察到的PaCO?升高至140-160 mmHg，單獨在正常氧條件下就會將pHi降低至6.5-6.6。同樣在本研究中，我們提供證據表明，在正常氧條件下，單獨吸入20%CO?（PaCO?:120 mmHg）會導致pHbrain下降至6.8。使用線性回歸（圖4C），我們計算出在我們PA模型中發展的高碳酸血癥（PaCO?:160 mmHg）單獨導致pHbrain下降至6.50，與之前的結果完全一致。PA期間的進一步酸化將主要由無氧糖酵解速率增加推動隨后的乳酸產生所決定。

糖酵解速率受葡萄糖向缺氧大腦輸送的限制，因為通過減少腦血流或血糖水平來減少其輸送會減弱酸中毒的發展。我們之前已經表明，在我們的PA模型中不會發生顯著的腦缺血，因為在大多數動物中，20分鐘PA期間MABP的下降（圖4）未達到血流自動調節的下限。誠然，我們模型中的PA持續時間不足以發展為嚴重窒息嬰兒常見的高碳酸血癥和心動過緩，然而，它可以很好地代表心血管適應機制耗盡之前的PA階段，并且可能發生最顯著的pHbrain改變。總之，我們當前的研究提供了新的令人信服的實驗證據，表明不僅是腦缺血，而且結合臨床相關水平的低氧、高碳酸血癥和高血糖的真正PA足以引發足夠嚴重（pHbrain<6.0）以強烈影響神經元存活的腦酸中毒。發展的pHbrain和pHa之間≥0.8個pH單位的差異表明跨血腦屏障的H?梯度>6倍，這與之前的發現一致，即新生豬的血腦屏障是成熟的，并且未因PA而嚴重受損。

pHbrain的改變不僅在急性PA期間發揮重要作用，在復蘇/再氧合后也具有重要病理生理學意義。先前的研究報道仔豬在從PA恢復后pHbrain保持穩定，但未對恢復4小時后的情況進行隨訪。相反，我們當前的研究將窒息后觀察期延長至24小時。我們發現在該仔豬PA/HIE模型中，PA后24小時期間未出現pHbrain的重大繼發性改變。

我們目前的發現與先前在仔豬HIE模型中使用MRS獲得的pHi數據一致，該模型使用缺氧缺血應激而非PA。在該研究中，pHi在缺血應激恢復后48小時內保持在基線水平，此外，繼發性能量衰竭的發展并未反映在該時間段內的pHi改變中。一項人類MRS研究也報道，在出生后第一天，窒息但血碳酸正常的足月新生兒中pHi正常（7.13±0.05），與我們的研究一致。重要的是，腦堿中毒在隨后幾天內發展，并持續數周甚至數月。

然而，我們需要指出，我們的PA/HIE仔豬模型代表了需要插管和呼吸支持但非自主呼吸的窒息嬰兒亞組。雖然機械通氣嬰兒保持血碳酸正常，但自主呼吸嬰兒經常過度通氣并可能發展為低碳酸血癥。這種反應可能反映了相對過度通氣，繼發于誘導的低氧性低代謝導致CO?產生減少。由于過度通氣導致的PaCO?降低傾向于升高pHbrain，這一觀點特別值得關注，因為低碳酸血癥已被確定為不良神經結局的獨立危險因素。在仔豬中，即使沒有窒息，中度低碳酸血癥也足以引起腦灌注減少，同時pH和乳酸水平升高。確實，我們的發現間接表明，維持血碳酸正常/輕度高碳酸血癥可能預防繼發性pHbrain改變。最近一項旨在建立大鼠和豚鼠出生窒息轉化有效小動物模型的工作發現，模擬出生窒息期間較高的PaCO?水平以及之后逐漸恢復血碳酸正常對腦代謝性酸中毒、氧氣和乳酸水平產生有益影響。顯然，需要進一步的研究在仔豬模型中探索這些效應。

我們當前的研究存在一些額外的局限性。我們僅使用一種窒息水平從新皮層收集pHbrain數據，未探索其他腦區和應激水平。

結論

我們的轉化性仔豬PA/HIE模型再現了出生窒息的所有主要特征，并在未采用頸動脈閉塞和/或出血性低血壓的情況下引發了顯著的神經元損傷。在該模型中，PA期間pHbrain降至6.0以下，比pHa低≥0.8個pH單位，確立了嚴重酸中毒在神經元損傷中的致病作用。然而，在恢復基線水平后，在24小時亞急性期內未觀察到繼發性pHbrain改變，這可能是由于通過控制機械通氣預防了繼發性低碳酸血癥。