2.實驗部分

2.1材料與表面制備方法

將2B表面光潔度的AISI 316冷軋不銹鋼板（X5CrNiMo17-12-2）切割成25.4x25.4毫米（1x1英寸）大小的載體。CLSM和pH監測測量使用25x75毫米的載體尺寸。AISI 316載體在Elplatek A/S Galvanord的商業化改性銅銀浴中，以4 A dm?2的電流電鍍1分鐘。在電鍍過程之前，樣品進行陰極脫脂（3±0.5 V，2分鐘），用去離子水沖洗，并在Wood's鎳沖擊液（4.5±0.5 A dm?2，2分鐘）中進行表面活化。銅銀合金涂層和未涂層的AISI 316載體分別用作測試載體和對照載體。

2.2銅合金表面作為消毒劑的功效

測試根據美國環保署（US EPA）批準的"銅合金表面作為消毒劑的功效測試方法"中報告的指南進行，并采用良好實驗室規范（GLP）。在測試前一天，每種材料和微生物的五個載體用70%異丙醇清潔，用去離子水沖洗，并風干。干熱滅菌后，每個載體放入單獨的sterile塑料培養皿中。根據方案指南，每個微生物使用六個不銹鋼和三個銅銀涂層載體進行載體存活率、載體定量、中和劑無菌性、中和劑確認和載體無菌性對照。每個測試的測試對照平行進行。金黃色葡萄球菌ATCC 6538、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC 33592、產氣腸桿菌ATCC 13048和銅綠假單胞菌ATCC 15442從-80°C儲備培養物中復蘇，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（Oxoid CM0131）上，在36±1°C（產氣腸桿菌為27±2°C）培養24小時。選取菌落轉移到1 mL胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（Oxoid CM0129）中，在36±1°C（產氣腸桿菌為27±2°C）培養24±2小時。將兩滿環（10μL）培養物轉移到10 mL TSB中，在36±1°C（產氣腸桿菌為27±2°C）培養24±2小時。此步驟重復三次。將4.7 mL細菌懸浮液轉移至新管中，加入0.25 mL熱滅活胎牛血清（FBS,Sigma F2442）和0.05 mL Triton X-100（Sigma-Aldrich），以產生5%FBS和0.01%Triton X-100的有機負載。將0.02 mL接種物涂布在載體上，距離載體邊緣約1/8英寸（≈3毫米）內，并在無菌工作臺中干燥約20分鐘。實驗期間記錄相對濕度為25%，實驗室溫度為23±2°C。120分鐘后，將載體轉移到含有20 mL中和劑溶液（改良Leetheen肉湯：Leetheen肉湯+0.07%卵磷脂+0.5%Tween 80）的單獨管中。將管子超聲處理5分鐘（28 kHz）（Delta 220;Deltasonic,Meaux,France）并旋轉以收集細菌。在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（Oxoid BR0014G）中進行10?1至10??系列稀釋，并取1 mL在TSA平板上平行涂布兩次。將平板置于無菌工作臺中，皿蓋微開以便在于36±1°C（產氣腸桿菌為27±2°C）培養48小時前干燥。使用菌落數在5-300范圍內的平板進行評估。每載體的CFU計算為相應稀釋度下每個平板的平均菌落數，乘以稀釋因子和中和溶液的體積，再除以涂布體積。報告對照和測試載體上存活微生物數量的幾何平均數，并用于計算減少百分比。還根據EPA方案指南測試了MRSA ATCC 33592對苯唑西林的抗菌敏感性。金黃色葡萄球菌ATCC 25923用作對照微生物，抑菌圈根據臨床和實驗室標準協會的指南進行判讀。

2.3銅合金表面細菌污染的持續減少

測試根據美國環保署（US EPA）批準的"銅合金表面細菌污染持續減少測試方法"中報告的指南進行，并采用良好實驗室規范（GLP）。測試程序按照前面部分概述進行，每個時間點每個微生物使用五個重復。載體（每個微生物25個銅銀涂層測試載體，15個不銹鋼對照載體，16個不銹鋼載體用于定量和存活率對照）在"0時"接種5μL接種物，并在無菌條件下風干。在初始接種后2、6、12、18和24小時，分別回收五個銅銀電鍍載體、三個不銹鋼對照載體和三個用于定量對照的不銹鋼載體。這些載體分別接種一次、兩次、四次、六次和八次。剩余的載體分別在3、6、9、12、15、18和21小時后重新接種5μL接種物。回收的載體轉移到含有20 mL中和劑溶液的單獨50 mL離心管中，超聲處理5分鐘（28 kHz）（Delta 220;Deltasonic,Meaux,France）并旋轉混勻。在PBS中進行系列稀釋（10?1-10??），并取1 mL在TSA平板上平行涂布兩次。干燥后，平板在36±1°C（產氣腸桿菌為27±2°C）培養48小時。計算中使用菌落數在5-300范圍內的平板。

2.4改良活/死染色測定和CLSM

使用含有0.2%SYTO 9綠色熒光核酸染料（Invitrogen,USA）和0.2%SYTOX AADvanced死細胞染料（Invitrogen,USA）的改良活/死染料混合物（溶于MilliQ水）來可視化和跟蹤與銅銀合金涂層表面接觸的細菌膜的殺滅過程。SYTO 9可以穿透完整（活細胞）和受損（死細胞）的膜，而SYTOX AADvanced只染色受損細胞。改良的染料混合物旨在允許直接檢查銅銀合金涂層基底上的細菌細胞。發現銅表面會干擾和吸收碘化丙啶（常用的死細胞染料）的熒光信號。這種效應是由于銅表面特有的光吸收特性，導致觀察到的熒光信號減弱或消失。改用SYTOX AADvanced是因為其發射光譜向更長波長偏移，因此可以在與銅表面接觸時觀察其信號。

金黃色葡萄球菌8325或銅綠假單胞菌PAO1從-80°C儲備培養物中復蘇，劃線接種于溶菌肉湯（LB）瓊脂平板（5 g L?1酵母提取物（Oxoid,Roskilde,Denmark),10 g L?1tryptone(Oxoid),10 g L?1NaCl(Merck,USA),pH 7.5)并在37±1°C下培養24±2小時。將改良的活/死染料混合物涂布在接種的平板上，在黑暗中培養5-10分鐘。使用5μL接種環，將染色的細菌從平板轉移到銅銀合金涂層或未涂層的AISI 316 25x75 mm載體上，模擬細菌生物膜，并用玻璃蓋玻片覆蓋。接種的載體立即在Zeiss LSM 880倒置共聚焦激光掃描顯微鏡下使用Plan-Apochromat 63x/1.40油鏡微分干涉對比(DIC)物鏡(Zeiss,Germany)進行檢查。使用488 nm激光進行激發，使用561 nm濾光片進行發射，以捕獲SYTO 9(發射峰498 nm)和SYTOX AADvanced(發射峰647 nm)的信號。金屬基底處的細菌以135μm x 135μm的視野成像，Z方向增量約為0.5μm。圖像堆棧在100分鐘的時間序列內每5分鐘捕獲一次。

2.5圖像處理和生物量定量：

圖像處理使用IMARIS軟件包(Bitplane AG,451 Switzerland)完成。通過使用COMSTAT 2(www.comstat.dk)對每種測試微生物和材料組合的三個實驗重復進行活細胞和死細胞比率的生物量定量，使用閾值因子5，不進行連通體積過濾。

2.6金屬表面的pH監測

金黃色葡萄球菌8325來自-80°C儲備培養物，劃線接種于LB平板，并在36±1°C下培養24±2小時。將單個菌落加入5 mL LB肉湯中，在36±1°C下培養24±2小時。在4000 g下離心5分鐘收集細菌細胞，重懸于0.15 M NaCl溶液中，并使用分光光度計(UV 1800,Shimadzu,Japan)調整至OD600為2.0。將0.15 M NaCl溶液配制的0.5%瓊脂糖熔化，并將4 mL倒入帶可拆卸腔室的單腔玻片(16 x 50 x 5 mm)(Ibidi,Germany)中。使瓊脂糖在室溫下冷卻并固化至少10分鐘，然后反轉凝膠基質以暴露更光滑的一面。將250μL金黃色葡萄球菌8325細菌懸浮液涂布在表面，風干5分鐘。使用pH微電極(PH25,尖端直徑≈25μm,Unisense A/S)進行pH測量，線性范圍為pH 4-9，90%響應時間<10秒。pH微電極與浸入瓊脂糖基質中的參比微電極(REF-100,尖端直徑≈100μm;Unisense A/S)結合使用，以確保與微電極的電接觸。

pH微電極通過在三種pH緩沖液(pH 4.01,7.00和10.01，在實驗溫度下)中的傳感器讀數進行校準，并在校準范圍內對pH呈線性響應，信號與pH的比率約為56 mV每pH單位。將pH電極連接到萬用表(Unisense A/S)，數據采集在運行軟件(SensorTrace Suite;Unisense A/S)的PC上進行。操作期間，將微傳感器安裝在連接PC的電動微操縱器(MM33-2,MC-232;Unisense A/S)上，由專用定位軟件(SensorTrace Suite;Unisense A/S)控制。將接種的凝膠基質放在銅銀合金涂層或未涂層的AISI 316基底載體(25x75 mm)上，并盡快將電極小心地放置在距金屬表面安全距離(<100μm)內。然而，在一個重復中，傳感器定位緩慢，未記錄到初始的pH上升。因此，使用模型(y=a(ln(x))+b)對該重復進行擬合，以extrapolate其初始pH上升。還在沒有細菌接種物的銅銀合金涂層或未涂層AISI 316表面監測了pH。此處，pH動力學比存在細菌時更快，因此為了捕獲初始的pH上升，將傳感器定位在靠近表面(<100μm)的位置，并在表面滴加一滴0.5%低熔點瓊脂糖(Ultra Pure LMP Agarose,Invitrogen,USA)，覆蓋傳感器和參比電極的尖端。液滴(100μL)在28°C下滴加，瓊脂糖在與合金涂層表面接觸后立即固化。

2.7金黃色葡萄球菌8325暴露于pH 8.0至9.5的1 M Tris-HCl緩沖液

金黃色葡萄球菌8325從-80°C儲備培養物中復蘇，劃線接種于腦心浸液(BHI)瓊脂平板(Oxoid,CM1135)上，并在36±1°C下培養24±2小時。將單個菌落加入5 mL BHI肉湯中，在36±1°C下培養24±2小時。制備1 M Tris-HCl緩沖液(121.1 g Tris Base(Trizma,Sigma-Aldrich),700 mL dH?O)，并使用濃HCl(Sigma-Aldrich)將pH調節至8.0,8.5,9.0,9.5。使用分光光度計(Novaspec III Visible Spectrophotometer,Amersham Biosciences)將細菌懸浮液調整至OD600為2.0，并將1 mL轉移至Eppendorf管(Eppendorf AG,Hamburg)中。在4000 g下離心5分鐘收集細菌細胞，并重懸于1 mL 1 M Tris-HCl緩沖液中。在暴露1小時和24小時后對細菌懸浮液進行取樣。通過系列稀釋和在BHI-瓊脂上鋪板測定懸浮液中細菌的存活密度(CFU mL?1)。所有實驗進行三個生物學重復；報告平均值和重復間的標準差(表2)。