鈣藻酸鹽珠內(nèi)生物量分布分析

鈣藻酸鹽珠內(nèi)生物量分布分析按所述方法進(jìn)行。珠內(nèi)生物量濃度測定通過將藻酸鹽珠溶解在1%檸檬酸鈉溶液中實(shí)現(xiàn)。定期收集液相并用新鮮檸檬酸鈉溶液替換。細(xì)胞密度如上所述測定。在此分析前后珠尺寸用卡尺測量，在氯化鈉和氯化鈣溶液中孵育5小時后。每種類型50個珠被測量以獲得足夠準(zhǔn)確性。

藻酸鹽珠內(nèi)pH梯度測量

包含固定化L.lactis亞種lactis的藻酸鹽珠從反應(yīng)器中取樣，并立即置于包含從反應(yīng)器流出物獲得的介質(zhì)的腔室中。流出物離心以去除自由細(xì)胞，介質(zhì)pH在這些測量前控制。測量腔室溫度通過循環(huán)介質(zhì)通過恒溫水浴控制在30°C，使用蠕動泵。此再循環(huán)環(huán)還提供劇烈攪拌以最小化外部質(zhì)量傳遞限制。測量使用pH微電極進(jìn)行，連接到手動微操縱器。微操縱器提供連續(xù)橫向移動定位，最小校準(zhǔn)單位相當(dāng)于20μm，尖端在立體顯微鏡觀察下定位。參考電極置于周圍介質(zhì)中。使用的pH電極尖端直徑為15μm。pH微電極在三個不同pH值校準(zhǔn)，測量的mV響應(yīng)與pH的關(guān)系通過線性回歸建立。

乳酸濃度測定

乳酸濃度在發(fā)酵期間間隔測定。樣品加入冷高氯酸中，離心并通過0.2-μm注射器過濾器過濾后進(jìn)行HPLC分析。使用色譜儀，配備自動進(jìn)樣器，使用Aminex HPX-87-H柱在45°C和RI檢測器。作為洗脫液，使用5 mmol l?1H?SO?。商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)用于校準(zhǔn)。

結(jié)果

藻酸鹽珠中包含乳酸乳球菌亞種lactis的生物量和活性分布

固定化細(xì)菌從鈣藻酸鹽珠的釋放與細(xì)菌在珠中的生長相關(guān)。隨著細(xì)菌生長，珠中生物量分布發(fā)生變化。為了研究這些變化，包含固定化L.lactis亞種lactis NCIMB 6681的珠在控制pH 6.5下連續(xù)發(fā)酵，并在不同發(fā)酵時間收獲進(jìn)行生物量分布分析。珠在開始和連續(xù)發(fā)酵5.5、12和48小時后的生物量分布如圖1所示。

最初，珠包含均勻分布的生物量。在連續(xù)發(fā)酵的前12小時內(nèi)，生物量分布發(fā)生變化，因?yàn)橹樽钔鈱拥纳锪繚舛缺戎橹行脑黾痈唷０l(fā)酵12小時后，珠最外層約150μm厚的層包含約73%的生物量。生物量濃度似乎不隨發(fā)酵延長在此層進(jìn)一步增加。在連續(xù)發(fā)酵48小時后分析的珠中，約73%的生物量位于珠最外層180μm內(nèi)。然而，在珠較深層也觀察到生物量濃度的輕微增加。在珠中心，生物量濃度在5.5至48小時發(fā)酵期間未觀察到變化。

生物量的代謝活性及其在珠內(nèi)的分布通過監(jiān)測乳酸生產(chǎn)速率進(jìn)行研究。使用直徑在1.4至3.5 mm之間的各種珠以研究珠尺寸對乳酸生產(chǎn)速率的影響。這些珠在pH 6.5下連續(xù)發(fā)酵48小時。在初始增加后，乳酸生產(chǎn)速率穩(wěn)定。穩(wěn)定后的乳酸生產(chǎn)速率如圖2所示，并表示為每種珠尺寸的乳酸生產(chǎn)速率與3.3 mm珠的乳酸生產(chǎn)速率的比值。每個速率基于總珠體積和總珠表面積呈現(xiàn)。較小直徑的珠似乎具有比較大的直徑珠更大的體積基準(zhǔn)乳酸生產(chǎn)速率。記錄的1.4 mm珠的體積基準(zhǔn)乳酸生產(chǎn)速率比3.3 mm珠觀察到的速率大90%以上。

然而，如果乳酸生產(chǎn)速率基于表面積而不是總體積計(jì)算，則觀察到較小差異。記錄的基于珠表面積的1.4 mm珠乳酸生產(chǎn)速率僅比參考珠觀察到的速率低14%。如圖2模擬所示，這些觀察與假設(shè)一致，即主要位于珠表面附近的細(xì)胞貢獻(xiàn)乳酸生產(chǎn)。

pH依賴性固定化乳酸乳球菌亞種lactis的性能

由于乳酸菌的生長伴隨乳酸生產(chǎn)，不同尺寸珠的結(jié)果表明大多數(shù)乳酸菌生長位于珠最外部。由于珠最外層生物量濃度似乎穩(wěn)定，該區(qū)域的生物量生長可能釋放到周圍介質(zhì)中。根據(jù)先前研究，珠內(nèi)部生物量被未解離乳酸和低pH抑制。因此，升高周圍介質(zhì)pH可能用于影響珠內(nèi)生物量分布和隨后細(xì)胞釋放，通過促進(jìn)珠內(nèi)部生長和抑制外圍生長。為了研究這個想法，記錄了L.lactis亞種lactis在給定培養(yǎng)基中不同控制pH值下的生長速率。基于這些實(shí)驗(yàn)，在固定化細(xì)菌連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中使用以下pH值：6.5、8.50、8.75、9.00和9.25。所有發(fā)酵在發(fā)酵前2小時在pH 6.5下運(yùn)行，以在珠中建立保護(hù)性pH梯度。細(xì)胞釋放速率，監(jiān)測為自由細(xì)胞生產(chǎn)速率，在發(fā)酵期間各種間隔測定。每個發(fā)酵的自由細(xì)胞生產(chǎn)速率如圖3所示。

珠內(nèi)生物量濃度和流出物中乳酸濃度在同一間隔測定。珠內(nèi)細(xì)胞密度在發(fā)酵期間的時間過程如圖4所示，而觀察到的乳酸生產(chǎn)速率如圖5所示。

為了確定觀察到的細(xì)胞釋放減少是否實(shí)際由于減少細(xì)胞釋放而非僅代謝活性降低的后果，細(xì)胞釋放速率與乳酸生產(chǎn)速率的比值在發(fā)酵期間間隔如圖6所示。

藻酸鹽珠內(nèi)pH梯度在發(fā)酵22小時于pH 6.50、9.00和9.25后如圖7所示。

細(xì)胞釋放速率在發(fā)酵早期階段增加。在pH 6.50下運(yùn)行的發(fā)酵在連續(xù)發(fā)酵12-15小時后達(dá)到穩(wěn)態(tài)細(xì)胞釋放速率。在接下來33小時發(fā)酵期間僅觀察到細(xì)胞釋放速率的微小變化。這與連續(xù)發(fā)酵期間內(nèi)部生物量分布分析結(jié)果一致。

隨著pH增加，觀察到細(xì)胞釋放速率的變化。然而，所有發(fā)酵，除了在pH 9.25下操作的發(fā)酵，在24小時內(nèi)達(dá)到與在pH 6.50下運(yùn)行的發(fā)酵相似的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞釋放速率。在pH 9.25下運(yùn)行的發(fā)酵中，隨著pH改變，觀察到細(xì)胞釋放速率的初始急劇下降，導(dǎo)致細(xì)胞釋放速率比其他發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)水平降低10倍。在發(fā)酵剩余期間，細(xì)胞釋放速率穩(wěn)定增加，但未看到穩(wěn)態(tài)。發(fā)酵48小時后，細(xì)胞釋放速率仍比在較低pH下發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞釋放速率低約10倍。

周圍介質(zhì)的改變條件也影響了發(fā)酵期間珠中生物量濃度的過程。在pH 6.5、8.5、8.75和9.00下發(fā)酵的珠中生物量濃度在連續(xù)發(fā)酵24小時內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)值。然而，在pH 9.25下發(fā)酵的珠中生物量從未在48小時發(fā)酵內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度。盡管周圍介質(zhì)pH增加減緩了內(nèi)部生物量濃度的初始增加，這些珠達(dá)到了生物量濃度約五倍于在pH 6.5、8.5、8.75和9.0下發(fā)酵的其他珠觀察到的穩(wěn)態(tài)生物量濃度。周圍介質(zhì)的改變pH似乎也影響了乳酸生產(chǎn)速率。在pH 9.25下運(yùn)行的發(fā)酵中乳酸生產(chǎn)速率在發(fā)酵早期階段不像其他發(fā)酵那樣增加，但與其他發(fā)酵相反，它在整個48小時發(fā)酵期間持續(xù)增加。在發(fā)酵結(jié)束時，在pH 9.25下運(yùn)行的發(fā)酵中觀察到乳酸生產(chǎn)速率增加25%，相比其他發(fā)酵，盡管細(xì)胞釋放速率仍相對低一個數(shù)量級。

這些大變化背后的機(jī)制假定與珠內(nèi)pH梯度差異相關(guān)。從圖7可見，在pH 9.00和9.25下發(fā)酵22小時的珠最外部pH梯度有顯著差異。在珠內(nèi)部，局部pH似乎差異較小。盡管在高pH下發(fā)酵的珠中pH梯度更陡，但在高pH下發(fā)酵的珠中心局部pH僅比在pH 6.5下發(fā)酵的珠高1.7單位。

因此，從圖6和圖7可見，可以改變介質(zhì)外部pH，使得生長在周圍介質(zhì)和珠外圍不利，而生長和乳酸生產(chǎn)在珠內(nèi)部繼續(xù)。這種情況改變了細(xì)胞釋放速率與乳酸生產(chǎn)速率的比值，導(dǎo)致產(chǎn)物流包含更少自由細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)也說明，從圖7和圖8可見，固定化由于擴(kuò)散限制和伴隨的珠內(nèi)pH梯度導(dǎo)致pH操作范圍的大偏移。

這些數(shù)據(jù)表明固定化細(xì)胞可以成功應(yīng)用于基于在pH耐受性極端上限操作的應(yīng)用。