摘要

無處不在的碳酸酐酶(CA)在催化二氧化碳向碳酸氫鹽和質(zhì)子的可逆水合過程中，在二氧化碳轉(zhuǎn)運、酸堿平衡以及將局部酸中毒與血紅蛋白的氧氣卸載聯(lián)系起來方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?？紤]到碳酸氫鹽和亞硝酸鹽之間的結(jié)構(gòu)相似性，我們假設(shè)CA使用亞硝酸鹽作為底物來產(chǎn)生強效血管擴張劑一氧化氮(NO)，以增加代謝活躍組織的局部血流量。在這里，我們展示了CA很容易與亞硝酸鹽反應(yīng)生成NO，尤其是在低pH值條件下，而且反應(yīng)中生成的NO能誘導(dǎo)主動脈環(huán)的血管擴張。這種反應(yīng)發(fā)生在常氧和缺氧條件下，以及CA和亞硝酸鹽處于生理水平的各種組織中。此外，CO2水合作用的兩種特異性抑制劑多佐胺和乙酰唑胺可增加CA催化亞硝酸鹽產(chǎn)生的具有血管活性的NO。這種增強效應(yīng)可能解釋了這些藥物的已知血管擴張作用，并表明二氧化碳和亞硝酸鹽與酶活性位點的結(jié)合方式不同。動力學(xué)分析表明，pH值較高時反應(yīng)速率較高，這表明陰離子亞硝酸鹽更有效地參與了催化反應(yīng)?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果揭示了一種新型的CA亞硝酸酐酶酶活性，這種酶活性可將體內(nèi)能量代謝的主要最終產(chǎn)物(CO2/H+)與血管活性NO的生成聯(lián)系起來。CA介導(dǎo)的NO生成可能對組織中血流與代謝活動之間的相關(guān)性非常重要，例如在大腦活躍區(qū)域就會出現(xiàn)這種情況。

引言

碳酸歧化酶(CA)是一種含鋅的無處不在的酶，有多種同工酶，可催化有氧代謝的主要最終產(chǎn)物二氧化碳(CO2)可逆地水合轉(zhuǎn)化為碳酸，形成碳酸氫鹽(HCO3-)和質(zhì)子：

CO2+H2O→H2CO3→HCO3-+H+(1)

CA除了在酸堿平衡和電解質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用外，還能有效地將血液中的氧氣輸送與組織代謝產(chǎn)生的二氧化碳聯(lián)系起來。作為已知速度最快的酶之一，紅細(xì)胞中的CA能夠在短時間(0.5秒)內(nèi)使活躍組織毛細(xì)血管中的血液因二氧化碳水化而產(chǎn)生局部pH值下降。這種局部酸中毒會通過玻爾效應(yīng)降低血紅蛋白的氧氣親和力，從而在氧氣張力不變的情況下將更多的氧氣卸載到活動組織中。

雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多CA抑制劑，但CO2和HCO3-是該酶唯一已知的底物。鑒于亞硝酸鹽和HCO3-之間的高度相似性(具有相同的三叉平面sp2軌道幾何形狀和幾乎相同的各自酸pKa值(分別為3.4和3.5))，并考慮到亞硝酸鹽已知可與CA的活性位點結(jié)合并抑制CO2水合，我們研究了CA使用亞硝酸鹽作為底物生成一氧化氮(NO)這種強效血管擴張劑的可能性。

NO合酶(NOS)生成的大部分氮氧化物會被氧化成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽在組織中的含量很低。雖然亞硝酸鹽是NO氧化的天然最終產(chǎn)物，但最近的研究表明，亞硝酸鹽也可能是哺乳動物組織中NO的重要來源，尤其是在心血管系統(tǒng)中。目前已發(fā)現(xiàn)幾種含金屬的酶，包括球蛋白、黃嘌呤氧化還原酶和線粒體醛氧化酶，它們可在缺氧或缺氧條件下有效催化亞硝酸鹽一電子還原為NO。雖然低氧水平與亞硝酸鹽在組織中轉(zhuǎn)化為NO之間的復(fù)雜耦合關(guān)系已得到廣泛研究，但能量代謝的最終產(chǎn)物(尤其是質(zhì)子)如何調(diào)節(jié)亞硝酸鹽生成NO的過程尚未完全明了。早期的研究表明，缺血心臟和主動脈血管中的pH值降低導(dǎo)致NO的形成依賴于亞硝酸鹽。莫丁(Modin)等人在一篇開創(chuàng)性論文中首次證明，生理水平的亞硝酸鹽可誘導(dǎo)NO依賴性主動脈血管舒張，尤其是在酸性pH值下，且與NOS活性無關(guān)。在這一過程中，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO的化學(xué)(非酶)酸化過程似乎過于緩慢，在體內(nèi)亞硝酸鹽濃度通常較低的情況下無法發(fā)揮主要作用，這表明存在一種特殊的催化劑。在這篇文章中，我們發(fā)現(xiàn)CA能在正常氧氣水平和pH值降低的情況下輕易地從亞硝酸鹽生成高水平的血管活性NO。CA的這一新穎生理特性有助于在氧氣張力低于臨界水平之前調(diào)節(jié)局部血流量，以應(yīng)對組織代謝活動的增加。

材料與方法

材料。多佐胺(Trusopt)來自默沙東公司。亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、純化的CA(來自牛紅細(xì)胞，含有CAII異構(gòu)體)、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿、不對稱二甲基精氨酸、氯化鋅、吲哚美辛和乙酰唑胺來自Sigma Aldrich。純化的CA在100℃下加熱變性10分鐘。按上述方法從純化的CA中制備載脂蛋白酶，用Milli-Q(Millipore)水透析，并進(jìn)行脂肪化。經(jīng)丹麥司法部批準(zhǔn)，對成年雄性Wistar大鼠(10-12wk)實施斬首和隨后的放血安樂死。用于化學(xué)發(fā)光的組織立即切除，切成小塊，用冰冷的PBS沖洗血液，勻漿，-80℃保存。從主動脈胸腔部分分離出用于微血管肌電圖等長張力記錄的動脈片段，并將其轉(zhuǎn)移到冷生理鹽水(見血管舒張實驗)中。

用微型一氧化氮電極測量NO的產(chǎn)生。使用NO100 NO敏感電極(Unisense)在10mM磷酸鹽緩沖液中測量NO含量，溫度為37℃，在開放室中不斷攪拌。一氧化氮電極的響應(yīng)時間為10秒。多佐胺、KNO2和CA的應(yīng)用如圖1所示。溶液用毫升Q水配制。用10秒的運行平均值對跡線進(jìn)行平滑處理。在37℃的厭氧磷酸鹽緩沖液中注入飽和氮氧化物氣體(2mM)的厭氧毫微克水，對電極進(jìn)行校準(zhǔn)。

動力學(xué)分析。使用Table Curve 2D軟件對微型一氧化氮電極獲得的動力學(xué)軌跡進(jìn)行非線性最小二乘法擬合分析。

用化學(xué)發(fā)光法測量NO的產(chǎn)生。實驗在一個裝有10mM磷酸鹽緩沖液和KNO2的反應(yīng)容器中進(jìn)行，該容器經(jīng)過預(yù)平衡并用N2吹掃，溫度為37℃，使用西弗斯一氧化氮分析儀(NOA 280i)以4s-1的采樣率檢測氣相中的NO。如圖3所示，應(yīng)用勻漿組織(2mg/ml)、多佐胺(250μM)和CA(10μM)。通過10秒的運行平均值對蹤跡進(jìn)行平滑處理，獲得的最大值用于進(jìn)一步分析。根據(jù)制造商的說明，用酸化碘化鉀將已知量的亞硝酸鹽完全還原成NO，進(jìn)行校準(zhǔn)。

血管舒張實驗。實驗使用微血管肌電圖儀進(jìn)行等張力記錄。如圖4所示，應(yīng)用NE(0.020μM)、NaNO2(10μM)、牛紅細(xì)胞純化CA(10μM)、乙酰唑胺(100μM)和多佐胺(250μM)。PSS含有(以mM為單位)119NaCl、25NaHCO3、4.7KCl、1.18KH2PO4、1.17MgSO4、1.6CaCl2、0.026EDTA和10葡萄糖，用5%CO2-21%O2-74%N2進(jìn)行平衡，并按之前所述進(jìn)行裝片、歸一化和活力控制。所有切片均與不對稱二甲基精氨酸(300μM)和吲哚美辛(3μM)孵育30分鐘，以分別抑制內(nèi)皮NOS和環(huán)氧化酶。在選定的實驗中，主動脈節(jié)段與選擇性CA抑制劑乙酰唑胺(100μM)或多佐胺(250μM)單獨或與1H-[1,2,4]惡二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，3μM)聯(lián)合孵育30分鐘，以抑制可溶性鳥苷酸環(huán)化酶。為誘導(dǎo)動脈節(jié)段穩(wěn)定收縮，在1%O2-5%CO2-94%N2條件下平衡5分鐘后，將NE加入肌電圖室。所使用的抑制劑均不影響NE收縮?；钚詮埩Χx為加入NE后的收縮水平減去經(jīng)過歸一化處理后在PSS中平衡30分鐘后的收縮水平。添加CA和亞硝酸鹽后的張力以活性張力的百分比表示。

統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SE表示，顯著性水平為P＜0.05，其中n代表單個實驗的次數(shù)。數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 11.0軟件(Systat)進(jìn)行非配對t檢驗分析。