摘要

Moraxella catarrhalis在生物膜中生長時(shí)，兩個(gè)開放閱讀框（ORFs）aniA和norB顯著上調(diào)，它們預(yù)測編碼亞硝酸還原酶和一氧化氮還原酶。一個(gè)位于aniA和norB之間的ORF被命名為nsrR，預(yù)測編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在三個(gè)不同的M.catarrhalis菌株中，通過DNA微陣列分析和定量逆轉(zhuǎn)錄PCR測量，nsrR的失活導(dǎo)致aniA和norB表達(dá)增加。在nsrR突變體中提供野生型nsrR基因可減少AniA蛋白表達(dá)。DNA微陣列分析顯示，另外兩個(gè)ORFs（MC ORF 683和MC ORF 1550）在nsrR突變體中持續(xù)上調(diào)。與野生型細(xì)胞相比，nsrR突變體細(xì)胞消耗亞硝酸和一氧化氮的速度更快。然而，低濃度亞硝酸鈉完全抑制了nsrR突變體的生長。這種亞硝酸鹽對生長的抑制在nsrR突變體中引入aniA突變后顯著逆轉(zhuǎn)，并在trans提供野生型nsrR基因后完全逆轉(zhuǎn)。NsrR對aniA表達(dá)的調(diào)控對亞硝酸鹽敏感，而NsrR對norB的調(diào)控對一氧化氮敏感。

引言

Moraxella catarrhalis曾被認(rèn)為是一種無害的共生于人類上呼吸道的微生物，但現(xiàn)在被公認(rèn)是一種能夠在人類上下呼吸道引起疾病的病原體。在嬰兒和幼兒中，M.catarrhalis是急性中耳炎的常見原因。在成人中，該菌引起的疾病可能呈現(xiàn)更嚴(yán)重的形式。它已被證明是慢性阻塞性肺病（COPD）急性加重的重要原因。據(jù)估計(jì)，美國每年有200萬至400萬COPD加重病例可歸因于M.catarrhalis。COPD是發(fā)達(dá)國家第四大死因，根據(jù)最新估計(jì)，到2020年，COPD預(yù)計(jì)將成為全球第三大死因。

M.catarrhalis在鼻咽黏膜表面的定植能力對其在其他解剖區(qū)域引起疾病至關(guān)重要，因?yàn)檫@種定植為M.catarrhalis在人類宿主中提供了立足點(diǎn)。事實(shí)上，M.catarrhalis在嬰兒期常見于鼻咽部定植，高定植率與中耳炎風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。迄今為止，M.catarrhalis定植鼻咽黏膜的機(jī)制尚未闡明，盡管過去幾年已鑒定出一些可能參與此過程的M.catarrhalis基因產(chǎn)物；這些基因產(chǎn)物基本上都是表面暴露蛋白，具有已證明的粘附活性。在人類鼻咽部，M.catarrhalis很可能與共生細(xì)菌一起以生物膜形式存在于黏膜上，最近有報(bào)道稱在中耳炎兒童的鼓室黏膜上檢測到M.catarrhalis生物膜。

目前只有少數(shù)研究在體外研究了M.catarrhalis的生物膜形成，其中一項(xiàng)研究確定了當(dāng)該菌以這種方式生長時(shí)上調(diào)的基因。在生物膜生長期間表達(dá)高度上調(diào)的基因中，有幾個(gè)預(yù)測編碼參與將硝酸鹽（NO3?）還原為一氧化二氮（N2O）的蛋白質(zhì)。這些上調(diào)基因包括編碼硝酸還原酶復(fù)合物的narGHJI基因簇、編碼亞硝酸還原酶的aniA（也被描述為主要厭氧誘導(dǎo)外膜蛋白）和編碼一氧化氮還原酶的norB。雖然將NO3?還原為亞硝酸鹽（NO2?）的能力是M.catarrhalis的一個(gè)已確立特征，可用于鑒定該菌，但上述另外兩種酶的存在表明M.catarrhalis具有表達(dá)截短脫氮途徑的潛力，僅缺乏將N2O轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮（N2）的能力。此外，從NO2?產(chǎn)生一氧化氮（NO）以及將NO還原為N2O的能力可能使M.catarrhalis在氧限制條件下更有效地呼吸，并保護(hù)自身免受宿主防御機(jī)制產(chǎn)生的NO的攻擊。最近對另一種最初定植鼻咽黏膜的病原體腦膜炎奈瑟菌的研究表明，其一氧化氮還原酶可以影響人類細(xì)胞中基于NO的信號傳導(dǎo)過程。

在本文中，我們證明M.catarrhalis憑借其AniA和NorB蛋白的表達(dá)能夠還原NO2?和NO。我們還顯示，位于aniA和norB基因之間的一個(gè)開放閱讀框（ORF）編碼NsrR，一種調(diào)控蛋白，控制AniA和NorB的表達(dá)水平。M.catarrhalis nsrR基因的失活導(dǎo)致AniA和NorB的過度表達(dá)，這與外源添加的NO2?對生長的抑制相關(guān)。我們還證明其他幾個(gè)M.catarrhalis基因直接或間接受NsrR調(diào)控。

材料與方法

細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件

本研究使用的M.catarrhalis菌株列于表1。使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基，肉湯培養(yǎng)物在37°C通氣培養(yǎng)。BHI培養(yǎng)基在適當(dāng)時(shí)補(bǔ)充卡那霉素（15μg/ml）或壯觀霉素（15μg/ml）。所有BHI瓊脂平板在37°C、含95%空氣和5%CO2的氣氛中培養(yǎng)。

為測量細(xì)菌生長，將細(xì)菌在BHI瓊脂上過夜生長，然后懸浮于BHI肉湯中至260 Klett單位密度。取1 ml懸浮液接種到500 ml燒瓶中的20 ml BHI肉湯中，在37°C以200 rpm振蕩培養(yǎng)。每小時(shí)測量生長濁度。

新鮮制備的2.5 M NaNO2水溶液經(jīng)過濾滅菌，在需要時(shí)添加到BHI肉湯中至終濃度5 mM。為研究NO對某些M.catarrhalis基因表達(dá)的影響，將spermine NONOate添加到細(xì)菌培養(yǎng)物中以產(chǎn)生NO。簡要來說，新鮮制備的25 mM spermine NONOate（溶于0.1 M NaOH）經(jīng)過濾滅菌，添加到對數(shù)期培養(yǎng)物中至終濃度50μM。繼續(xù)生長45分鐘后，再次添加spermine NONOate至相同終濃度。再生長45分鐘后，收獲細(xì)胞用于提取總RNA。對照培養(yǎng)物接收等量的0.1 M NaOH。

全細(xì)胞裂解物制備和Western blot分析

全細(xì)胞裂解物從BHI瓊脂生長的細(xì)胞中制備，如先前所述。Western blot分析按先前所述進(jìn)行。