多克隆抗體生成

合成包含M.catarrhalis ATCC 43617預測AniA蛋白氨基酸236至258的寡肽（YTKGKYGEQGLQPF DMEKAIRED），用于免疫小鼠生產多克隆AniA抗體。

一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N2O）和亞硝酸根（NO2-）生成與消耗的測定。

為測定存在NO2-條件下的NO生成，將卡他莫拉菌O35E野生型、nsrR突變株和aniA突變株在BHI肉湯中培養至600 nm光密度（OD600）為2.0。隨后洗滌細胞并重懸于新鮮BHI肉湯使OD600為1.0，加入5 mM（終濃度）亞硝酸鈉后，使用經MLT1122模擬適配器系統（AD Instruments，科羅拉多斯普林斯）連接的ISO-NOPMC Mark II電極（WPI Instruments，薩拉索塔）監測NO生成，并按照制造商說明制作標準曲線。測定NO2-消耗時，將卡他莫拉菌O35E野生型、aniA、nsrR及nsrR aniA菌株培養至OD600為2.0，洗滌后重懸于BHI肉湯使OD600為1.0。

加入5 mM（終濃度）亞硝酸鈉后，采用標準格里斯法測定剩余NO2-濃度：簡要而言，70℃孵育5分鐘后通過離心收集細胞制備培養上清液，取100μl上清液與100μl混合試劑（含1%磺胺的2.5%磷酸溶液與0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽的2.5%磷酸溶液按1:1混合）室溫反應15分鐘，通過測定550 nm處混合液吸光度并對照標準曲線確定NO2-濃度。

卡他莫拉菌野生型O35E及其同源nsrR突變株的NO消耗活性測定：將菌株在BHI培養基中培養至OD600為2.0，洗滌后重懸于BHI肉湯使OD600為1.0，加入10 mM ProliNO（半衰期1.8秒；AG Scientific，圣地亞哥）產生20μM NO，使用ISO-NOPMC Mark II電極（WPI Instruments）監測不同時間點殘留溶解NO濃度。野生型、aniA、nsrR及nsrR aniA卡他莫拉菌O35E菌株的N2O生成監測采用氧不敏感型N2O特異性探頭（N2O-50-3112；Unisense AS，奧胡斯）連接皮安表（PA2000；Unisense AS）并通過模數轉換器（ADC 216；Unisense AS）運行。將菌株在BHI肉湯中培養至OD600為2.0后,重懸于BHI培養基使終OD600為1.0，然后添加5 mM（終濃度）NaNO2，監測N2O產生。

核苷酸序列登錄號

本研究中包含的norB、nsrR和aniA基因核苷酸序列的GenBank登錄號如下：M.catarrhalis O35E為EU861986；M.catarrhalis 7169為EU861987；M.catarrhalis ETSU-9為EU861988。M.catarrhalis ATCC 43617的norB、nsrR和aniA基因核苷酸序列已登錄，登錄號為AX067454。

結果

aniA和norB基因所在基因座的DNA序列分析

先前研究表明，M.catarrhalis在生物膜狀態下生長導致許多不同基因上調，包括幾個預測編碼參與異化硝酸鹽還原途徑蛋白的基因。除了編碼硝酸還原酶復合物組分的基因，預測編碼亞硝酸還原酶（aniA）和一氧化氮還原酶（norB）的基因是這些高度上調基因之一。檢查M.catarrhalis ATCC 43617基因組顯示，aniA和norB基因彼此靠近，并以相同方向轉錄（圖1B）。預測的M.catarrhalis AniA蛋白與淋病奈瑟菌AniA亞硝酸還原酶（先前稱為厭氧誘導主要外膜蛋白）有68%同一性。M.catarrhalis norB基因編碼的預測蛋白與腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的NorB一氧化氮還原酶相似（64%至65%同一性）。

第三個ORF（MC ORF 680）位于norB和aniA基因之間，并以相反方向轉錄（圖1B）。該ORF編碼的蛋白被命名為NsrR（原因如下）。182個氨基酸的NsrR蛋白最相似（51%同一性）于Psychrobacter sp.菌株PRwf-1中發現的預測BadM/Rrf2轉錄調控因子。M.catarrhalis NsrR蛋白也與腦膜炎奈瑟菌MC58 NsrR抑制子相似（35%同一性），該蛋白控制該病原體中參與異化亞硝酸還原的基因表達。進一步檢查M.catarrhalis NsrR蛋白序列顯示，它包含RirA的保守結構域，一種新型鐵響應轉錄調控因子，發現于固氮細菌中，可能具有類似Fur蛋白的功能。

在初步努力確定aniA、nsrR和norB基因在M.catarrhalis菌株中的保守程度時，使用引物對WW247/WW207和WW210/WW211（圖1B和表2）擴增重疊DNA片段，使用從M.catarrhalis菌株O35E、7169和ETSU-9分離的基因組DNA作為模板。核苷酸序列分析顯示，這三個菌株的預測AniA和NsrR蛋白氨基酸序列相同，而NorB蛋白在這些菌株之間存在少量氨基酸差異。

M.catarrhalis nsrR突變體構建

基于DNA微陣列的研究顯示，norB和aniA是生物膜生長M.catarrhalis細胞中上調最多的基因之一，也表明這兩個基因在鐵限制條件下生長時是下調最多的基因之一。盡管這兩個基因顯示相同的調控模式，但從它們在染色體中的排列看，它們不在一個操縱子中。為確定NsrR蛋白是否可能參與norB和aniA基因表達的調控，我們構建了nsrR突變體，首先在菌株ETSU-9中，然后在菌株O35E和7169中，如材料與方法所述。