ETSU-9野生型和nsrR突變體細胞中aniA表達的qRT-PCR分析

使用從M.catarrhalis ETSU-9野生型和nsrR突變體細胞在浮游狀態、鐵限制條件下和生物膜中生長的總RNA樣本，通過qRT-PCR測量aniA表達。在野生型菌株中，aniA表達在鐵限制培養基中下調，在生物膜中上調超過10倍（圖2），與先前在M.catarrhalis ATCC 43617中觀察到的相同。相反，在nsrR突變體中，aniA在所有三種生長條件下均上調，相對增加最大（超過100倍）在生物膜生長細胞中（圖2）。這些結果表明，nsrR基因可能編碼一種調控蛋白，在有氧生長條件下抑制aniA表達。

圖2.卡他莫拉菌ETSU-9野生型及突變株在不同生長條件下通過qRT-PCR檢測ani4基因的表達情況。分別從浮游生長狀態（PT）的野生型ETSU-9（wt）和nsrR突變株（nsrR）中提取總RNA，這些菌株在含30μM去鐵胺（DF30）的肉湯中進行鐵限制培養，并如先前文獻（62）所述采用連續流生物膜系統（BF）培養。qRT-PCR實驗方法詳見材料與方法部分。

NsrR對AniA表達的影響

在M.catarrhalis菌株O35E和ETSU-9中失活aniA基因，如材料與方法所述（圖1D）。aniA突變體最初在Western blot分析中用作陰性對照，以測量AniA表達。此外，我們將野生型nsrR基因從M.catarrhalis ATCC 43617克隆到pWW115中。重組質粒pWW150包含此nsrR基因，用于轉化O35E和ETSU-9 nsrR突變體。這兩個突變體也分別用質粒載體pWW115轉化。

野生型O35E細胞（圖3A，泳道1）和野生型ETSU-9細胞（圖3A，泳道6）表達非常低水平的AniA。相反，O35E nsrR突變體（圖3A，泳道2）和ETSU-9 nsrR突變體（圖3A，泳道7）表達易于檢測量的AniA。如預期，O35E aniA突變體（圖3A，泳道3）和ETSU-9 aniA突變體（圖3A，泳道8）不表達AniA蛋白。質粒攜帶的野生型nsrR基因消除了O35E nsrR(pWW150)（圖3A，泳道5）和ETSU-9 nsrR(pWW150)（圖3A，泳道10）中可檢測的AniA表達。質粒載體單獨存在于O35E nsrR(pWW115)（圖3A，泳道4）和ETSU-9 nsrR(pWW115)（圖3A，泳道9）中對這兩個突變體的AniA表達沒有明顯影響。

圖3.NsrR對卡他莫拉菌野生型、突變型及回補突變株中AniA蛋白表達的影響。通過Western blot分析，采用多克隆AniA抗血清(A)或CopB特異性單克隆抗體10F3(18)(B)作為一抗對菌株全細胞裂解液進行檢測。泳道1：野生型菌株O35E；泳道2：O35E nsrR突變體；泳道3：O35E aniA突變體；泳道4：O35E nsrR(pWW115)；泳道5：O35E nsrR(pWW150)；泳道6：野生型ETSU-9；泳道7：ETSU-9 nsrR突變體；泳道8：ETSU-9 aniA突變體；泳道9：ETSU-9 nsrR(pWW115)；泳道10：ETSU-9 nsrR(pWW150)。推測的AniA單體和二聚體位置由A圖右側箭頭標示。CopB外膜蛋白作為上樣對照，其位置由B圖右側箭頭標示。各圖左側均標有分子量標準物的位置。

NO2?對M.catarrhalis野生型、突變體和互補突變體菌株生長的影響

為開始探索M.catarrhalis NsrR蛋白的生物學意義，研究了不同氮化合物對M.catarrhalis生長的影響。在肉湯生長培養基中包含5或10 mM NaNO3對野生型O35E菌株及其nsrR突變體的生長沒有可檢測影響。5 mM NaNO2的存在對野生型O35E的生長影響很小或沒有影響（圖4A）。類似地，NO2?對O35E aniA突變體的生長最多有非常輕微的影響（圖4B）。相反，5 mM NO2?完全抑制了O35E nsrR突變體的生長（圖4C）。在7169和ETSU-9菌株的nsrR突變體中觀察到相同的NO2?抑制效應。這種NO2?對生長的抑制在O35E nsrR突變體背景中引入aniA突變后顯著逆轉（圖4D），并在trans提供野生型nsrR基因后完全逆轉（圖4F）。如預期，質粒載體pWW115單獨存在于O35E nsrR突變體中對其在NO2?存在下的生長沒有影響（圖4E）。

圖4.亞硝酸鹽對卡他莫拉菌野生型、突變體及回補突變株生長的影響。野生株O35E(A)、O35E aniA突變體(B)、O35E nsrR突變體(C)、O35E△nsrR aniA突變體(D)、O35E nsrR(pWW115)(E)及O35E nsrR(pWW150)(F)分別于BHI培養基(■)和含5 mM亞硝酸鈉的BHI培養基(▲)中培養。除B組數據來自兩次獨立實驗外，其余數據均為三次獨立生長實驗的平均值。