討論

O.disjunctus是一種黑蜣科甲蟲，是一種大型且眾所周知的節(jié)肢動(dòng)物食碎屑動(dòng)物，廣泛分布于北美東部和加拿大南部。這些甲蟲表現(xiàn)出亞社會(huì)行為，棲息在腐爛的硬木中，并以低營(yíng)養(yǎng)飲食為生，這一特征在白蟻中已被證明需要共生微生物（如細(xì)菌和鞭毛蟲）的存在，這些微生物有助于固氮和木質(zhì)纖維素消化。

黑蜣科甲蟲提供了一個(gè)有用的天然模型來研究微生物群落在植物細(xì)胞壁降解中的作用，因?yàn)樗軌蛞愿癄€木材的低營(yíng)養(yǎng)飲食為生，其中許多涉及的降解過程需要微生物酶的活性。在這項(xiàng)研究中，我們首次深入了解了這種甲蟲消化道中的微生物群落組裝、其功能的一個(gè)方面（N固定）以及可能調(diào)節(jié)微生物組成和活性的生理梯度（O2、pH）。我們假設(shè)，腸道區(qū)域之間觀察到的形態(tài)和生理差異允許在每個(gè)腸道區(qū)域內(nèi)存在不同的微生物種群和活性。

一些可能影響后腸微生物群落組合的因素包括氧氣可用性、pH、氧化還原電位以及生物之間的相互作用。O2分布的分析顯示，所有腸道區(qū)域都形成了O2梯度，其特征是從微需氧條件到厭氧條件的快速轉(zhuǎn)變，氧氣可利用區(qū)域的深度在FG和MG中比在AHG和PHG中更大。氧氣梯度在白蟻中已被廣泛表征；然而，與黑蜣科甲蟲不同，已知白蟻如Microcerotermes parvus和Reticulitermes flavipes僅在囊部（一種類似于O.disjunctus中AHG的消化結(jié)構(gòu)）或Nasutitermes lujae的后后腸后半部分充當(dāng)“氧氣匯”。在所有腸道區(qū)域都存在達(dá)到厭氧條件的O2梯度，這使得黑蜣科甲蟲成為一個(gè)獨(dú)特的系統(tǒng)，用于研究微生物種群沿腸道區(qū)域和跨腸道區(qū)域的排列以及代謝過程，如木材大分子的降解和潛在生物燃料（如CH4和H2）的產(chǎn)生。為了表征O.disjunctus腸道中的pH變化，我們進(jìn)行了腸道內(nèi)容物的整體pH測(cè)量，其方法與Bignell和Eggleton用于測(cè)定白蟻腸道pH的方法相當(dāng)。與至少一個(gè)腸道區(qū)域（后腸或囊部）呈極堿性（高達(dá)10.5）的高等白蟻不同，我們發(fā)現(xiàn)甲蟲腸道環(huán)境不那么極端，盡管MG是堿性的（pH 8.38；表1）。這與許多其他昆蟲和哺乳動(dòng)物腸道中發(fā)現(xiàn)的pH條件形成對(duì)比，這些腸道需要高度堿性或酸性環(huán)境才能進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖澄锵?

總的來說，系統(tǒng)發(fā)育微陣列和454焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，在大多數(shù)腸道區(qū)域中，門內(nèi)的豐富度順序?yàn)樽冃尉T（Proteobacteria）>厚壁菌門（Firmicutes）>放線菌門（Actinobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes），但AHG區(qū)域除外。這里的豐富度順序?yàn)楹癖诰T（Firmicutes）>變形菌門（Proteobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes）>放線菌門（Actinobacteria），表明選擇了一個(gè)獨(dú)特的種群。觀察到的MG和PHG之間多樣性和群落結(jié)構(gòu)的相似性可能與這些區(qū)域的形態(tài)有關(guān)，MG和PHG都缺乏在AHG中看到的復(fù)雜的腸道結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能支持微生物庫的建立。FG和AHG的高度聚集的微生物組合和多樣性模式也可能與O2可用性有關(guān)。FG中O2滲透距離更大，同時(shí)厭氧區(qū)相對(duì)于AHG減少（圖2），這可能解釋了特定微生物類群的不同分布。例如，需氧固氮細(xì)菌和放線菌在FG中相對(duì)更豐富，而在AHG中未檢測(cè)到或相對(duì)豐度較低。盡管FG在重量上比其他區(qū)域小，但其細(xì)菌多樣性最高。相比之下，AHG的多樣性最低，O2可用性也最低（圖2）。所有腸道區(qū)域在系統(tǒng)發(fā)育上都是聚集的，表明發(fā)生了棲息地過濾。因此，盡管FG區(qū)域在檢測(cè)到的分類群數(shù)量、香農(nóng)多樣性和總系統(tǒng)發(fā)育距離（Faith's PD）方面是最多樣化的，但FG中的生物彼此之間的關(guān)系比AHG中的生物更密切（表1）。這一發(fā)現(xiàn)出乎意料，但可能與O2作為末端電子受體的相對(duì)豐度有關(guān)。

與其他腸道區(qū)域不同，AHG在形態(tài)上高度分化，顯示出內(nèi)部囊袋和突起，這將允許空間分離，促進(jìn)更高多樣性的生態(tài)位，從而產(chǎn)生更高的分類學(xué)多樣性，正如在其他昆蟲腸道中觀察到的那樣。然而，較低的O2滲透和更廣泛的厭氧區(qū)可能導(dǎo)致較低的電子受體多樣性，這可能會(huì)抵消空間分離對(duì)該區(qū)域多樣性的影響（圖5）。在比較所有腸道區(qū)域的微生物組成時(shí)，AHG的特征是厭氧類群的富集，這些類群可能有助于重要的代謝過程，如木質(zhì)纖維素材料的轉(zhuǎn)化、N2固定、H2和CH4的產(chǎn)生。只有在這個(gè)區(qū)域內(nèi)才檢測(cè)到產(chǎn)甲烷菌，如甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）。有趣的是，甲烷氧化菌如甲基球菌目（Methylococcales）在與AHG相鄰的區(qū)域（可能是甲烷的來源）檢測(cè)到的相對(duì)豐度更高（圖5）。在AHG中，我們檢測(cè)到一些厭氧類群的代表，這些類群因其在生物技術(shù)中的重要性而被廣泛研究，例如產(chǎn)H2的C.tyrobutyricum，或芳香族o-脫甲基化同型產(chǎn)乙酸菌C.methoxybenzovorans。同樣在AHG中富集的螺旋體，已被報(bào)道為白蟻腸道生物區(qū)系的重要組成部分，因?yàn)樗鼈兙哂泄痰屠w維素降解能力，盡管在這種情況下我們沒有看到該組中nifH基因表達(dá)的證據(jù)。在AHG中，擬桿菌門（Bacteroidetes）包括紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）相對(duì)于鄰近區(qū)域富集（圖4）。FG和PHG區(qū)域的特征是需氧細(xì)菌的相對(duì)豐度較高，特別是纖維素分解類群，如Cellulophaga、Cellulosimicrobium以及需氧固氮生物，如慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）。顯然，甲蟲腸道可以被視為一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其中代謝過程似乎是空間分散的。

在所有腸道區(qū)域都存在達(dá)到完全O2耗盡的徑向O2梯度，以及這些甲蟲賴以生存的木質(zhì)生物量的高C:N比，預(yù)計(jì)會(huì)選擇固氮作用。我們首先通過15N2同位素比質(zhì)譜法評(píng)估了這種可能性，并證明所有腸道區(qū)域都發(fā)生了15N2富集。為了確定固氮的可能位置，通過使用nifH-qPCR對(duì)固氮酶基因表達(dá)進(jìn)行定量。這表明nifH表達(dá)在AHG中最高（比FG高27倍；表2），主要的nifH轉(zhuǎn)錄本序列與紫單胞菌目（Porphyromonadales）成員P.propionicigenes的Ni-Fe固氮酶以及梭菌目（Clostridiales）成員C.lentocellum（一種纖維素分解固氮細(xì)菌）的Ni-Fe固氮酶相關(guān)。NifH表達(dá)結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)，即由于不同的生理?xiàng)l件（即每個(gè)腸道區(qū)域O2濃度的變化）導(dǎo)致微生物組成和功能分離。nifH轉(zhuǎn)錄本的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育微陣列分析非常吻合，證實(shí)了FG、MG和PHG中存在需氧固氮細(xì)菌，以及厭氧生物如梭菌目（Clostridiales）和紫單胞菌目（Porphyromonadales）。重要的是，在所有腸道區(qū)域都檢測(cè)到nifH表達(dá)，并且FG、MG和PHG不僅包含與P.propionicigenes相關(guān)的固氮細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本，還包含需氧固氮細(xì)菌類群。這種需氧和厭氧固氮菌的共存可能與整個(gè)甲蟲腸道中微需氧區(qū)域的存在有關(guān)，并表明N2固定存在一定程度的功能冗余。如前所述，未檢測(cè)到螺旋體相關(guān)的nifH轉(zhuǎn)錄本；這一觀察結(jié)果可能與引物偏倚無關(guān)，因?yàn)橄嗤膎ifH引物被用于鑒定白蟻中的固氮螺旋體。這表明，與白蟻后腸中螺旋體是主要固氮類群不同，在黑蜣科甲蟲腸道中，這一作用主要由擬桿菌門物種（Paludibacter）和其他生物承擔(dān)。

我們的多尺度方法表明，黑蜣科甲蟲的腸道是一個(gè)高度區(qū)室化的環(huán)境，具有明確分層的微生物群落，范圍從具有高多樣性需氧類群的區(qū)域（FG、PHG）到主要由厭氧細(xì)菌主導(dǎo)的AHG。黑蜣科甲蟲腸道擁有高度多樣化的固氮細(xì)菌群落，其優(yōu)勢(shì)生物與P.propionicigenes相關(guān)，而不是在白蟻中發(fā)揮這一作用的螺旋體。甲蟲腸道的特征是存在徑向O2梯度，達(dá)到厭氧條件，在管腔內(nèi)的所有區(qū)域中占主導(dǎo)地位。基于此，有氧和厭氧過程很可能在近距離內(nèi)發(fā)生，并有助于這種昆蟲中木質(zhì)纖維素降解的效率。了解這些種群如何在區(qū)域之間和跨梯度相互作用以促進(jìn)這種昆蟲的營(yíng)養(yǎng)，是進(jìn)一步研究的主題，并將提高我們優(yōu)化木質(zhì)纖維素生物燃料生產(chǎn)過程的能力。