還研究了傳質(zhì)對(duì)SWASV響應(yīng)的影響（攪拌與不攪拌）。常規(guī)SWASV測(cè)量在沉積步驟中使用攪拌來增加目標(biāo)重金屬離子向電極的質(zhì)量傳輸；然而，在不攪拌的條件下（模擬柑橘植物維管束內(nèi)部），減少的質(zhì)量傳輸可能成為Zn2+原位沉積的限制因素。圖7-5(b)顯示了不同微電極尖端尺寸在不攪拌條件下的校準(zhǔn)曲線。對(duì)于85、48和12 μm的尖端尺寸，在不攪拌條件下，斜率和LOD受到嚴(yán)重影響。85、48、12和10 μm尖端尺寸的LOD分別增加了3,440%、1,710%、500%和80%。類似地，85和48 μm尖端尺寸的線性范圍也減小了，可能是由于質(zhì)量傳輸限制，但12和10 μm尖端尺寸在攪拌和不攪拌條件下的線性范圍保持不變。表7-1比較了攪拌和不攪拌條件下的斜率、線性范圍和LOD。這些結(jié)果表明，與較大的尖端尺寸相比，質(zhì)量傳輸限制對(duì)較小尺寸的影響較小。同樣明顯的是，凹陷增強(qiáng)了攪拌對(duì)電極響應(yīng)的影響。例如，一個(gè)帶有凹陷的12 μm電極，在沉積過程中沒有攪拌時(shí)，其LOD增加了500%，但一個(gè)尺寸類似（10μm）沒有凹陷的電極并未顯示出LOD的顯著下降。這些發(fā)現(xiàn)與其他文獻(xiàn)一致（Bartlett等，2000），并且尤為重要，因?yàn)榧舛顺叽巛^小的微電極可以減輕在預(yù)濃縮步驟中對(duì)攪拌的需求，從而實(shí)現(xiàn)原位測(cè)量。總體而言，在生物學(xué)應(yīng)用中使用了一個(gè)在45-90 μm范圍內(nèi)的鉍尖端尺寸（作為工作電極），以最小化質(zhì)量傳輸干擾，并最大化LOD和斜率。

表7-1. 使用開發(fā)的鉍微電極，尖端尺寸對(duì)Zn2+的SWASV響應(yīng)的質(zhì)量傳輸干擾的影響

在柑橘植物維管束中使用SWASV原位檢測(cè)Zn2+

組合式鉍/鉑微電極被應(yīng)用于柑橘植物維管束中的Zn2+檢測(cè)。雙管微電極的結(jié)構(gòu)允許工作電極和參比電極同時(shí)穿透柑橘葉片的維管束，以進(jìn)行Zn2+的SWASV測(cè)定。與單管鉍微電極相比，組合式鉍/鉑微電極顯示出更高的耐用性，并且未被葉片表面損壞。雙管鉍/鉑微電極的總尖端直徑為110 μm，工作鉍電極直徑為70 μm。校準(zhǔn)曲線顯示對(duì)Zn2+具有優(yōu)異的靈敏度，斜率為0.172 μA/ppm Zn2+，R2值為0.996（圖7-5(a)）。應(yīng)用于植物后的校準(zhǔn)曲線顯示響應(yīng)為0.187 μA/ ppm Zn2+，表明微電極在穿透過程中未被損壞。通過顯微鏡觀察，還發(fā)現(xiàn)與植物組織的直接接觸對(duì)微電極尖端沒有影響。前校準(zhǔn)和后校準(zhǔn)曲線（圖7-5(a)）也顯示LOD為0.92 ppm，并且使用壽命研究表明電極的響應(yīng)在18次使用中沒有變化（附錄E），這對(duì)于檢測(cè)植物中的Zn2+目的是可接受的。

圖7-5(b)顯示了微電極對(duì)經(jīng)處理（1 mM ZnCl2處理6小時(shí)）和未處理（去離子水處理6小時(shí)）柑橘葉片中脈中Zn2+濃度的響應(yīng)。兩片獨(dú)立的處理葉（1和2）產(chǎn)生的SWASV響應(yīng)分別為1.2 μA（處理1）和1.4 μA（處理2），而兩片獨(dú)立的未處理葉片對(duì)Zn2+的響應(yīng)（0.06 μA和0.003 μA）與處理葉相比可忽略不計(jì)。使用前校準(zhǔn)和后校準(zhǔn)曲線（圖7-5(a)），確定處理葉中含有5.73±0.88 ppm Zn2+，而未處理葉中含有不可檢測(cè)量的Zn2+。雖然處理葉中Zn2+濃度的增加是預(yù)期的，但由于使用了不同的分析方法，測(cè)量值難以用現(xiàn)有文獻(xiàn)驗(yàn)證。大多數(shù)研究主要使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）或原子吸收光譜（AAS）檢測(cè)Zn2+，這些方法需要將樣品干燥、研磨和消解后才能分析（1998）。這導(dǎo)致鋅濃度以每千克干重毫克數(shù)報(bào)告。一項(xiàng)使用更直接的鋅測(cè)量方法——微X射線熒光（μ-XRF）的研究報(bào)告了以毫克每千克干重為單位的Zn2+濃度（酸橙植物中為34.6至42.4 mg kg-1）（Tian等，2014）。考慮到μ-XRF測(cè)定的是總鋅濃度，并且干重測(cè)量（毫克Zn/千克生物質(zhì)）和原位測(cè)量（毫克Zn2+/升）之間存在差異，使用原位SWASV的測(cè)量似乎是合理的。

圖7-5. 開發(fā)的微電極在植物中的原位應(yīng)用。（a）使用兩步SWASV方法的組合式鉍/鉑參比微電極的前校準(zhǔn)和后校準(zhǔn)曲線。（b）使用雙管鉍/鉑微電極在未處理（去離子水）和處理（1 mM ZnCl2）柑橘葉片中原位檢測(cè)Zn2+。

盡管使用基于SWASV的微電極監(jiān)測(cè)柑橘植物中Zn2+濃度的好處是顯而易見的，但仍有一些局限性需要解決。特別是，已知在沉積步驟中會(huì)形成銅-鋅金屬間化合物，并干擾電極響應(yīng)（Sanna等，2000）。然而，對(duì)金屬間Cu-Zn化合物干擾的量化超出了本文的范圍，因?yàn)榧僭O(shè)柑橘葉片中的Cu2+濃度將顯著低于Zn2+（Sanna等，2000）。對(duì)于其他Zn2+和Cu2+同時(shí)以高濃度存在的應(yīng)用，我們建議一種可能的解決方案是使用不同的沉積電位（例如，-0.6 V），該電位比還原Zn2+所需的電位更正，以確定Cu-Zn化合物的形成是否可能成為電極響應(yīng)的問題。隨著在重現(xiàn)性和代表性方面更多的驗(yàn)證，預(yù)計(jì)這種使用兩步SWASV的新方法將提供一種簡(jiǎn)單、快速且可重現(xiàn)的植物中Zn2+檢測(cè)方法，能夠區(qū)分處理和未處理的樣品。總體而言，本研究證明了使用基于SWASV的微電極技術(shù)作為一種直接、快速的方法，以微創(chuàng)方式監(jiān)測(cè)韌皮部組織中Zn2+濃度的可行性。

結(jié)論

構(gòu)建了一種基于金屬鉍（Bi）的微電極，并對(duì)其用于檢測(cè)Zn2+的兩步SWASV概念進(jìn)行了驗(yàn)證測(cè)試。我們能夠證明使用Zn2+原位沉積和異位溶出的兩步SWASV測(cè)量的可行性。研究還發(fā)現(xiàn)，可以通過優(yōu)化尖端尺寸來減少傳質(zhì)限制并改善檢測(cè)限。隨后，將鉍微電極與鉑微電極組合成雙管微電極結(jié)構(gòu)，用于直接測(cè)量植物中的Zn2+。我們的結(jié)果表明，Bi/Pt微電極的固體金屬尖端（直徑110 μm）足夠堅(jiān)固，可以穿透柑橘葉片的厚表皮。總體而言，所開發(fā)的Bi/Pt微電極能夠?qū)Ω涕偃~片中脈中的Zn2+產(chǎn)生響應(yīng)，并能以高分辨率區(qū)分經(jīng)Zn2+處理與未處理樣品之間的Zn2+濃度。這種新穎的原位檢測(cè)方法能夠直接在植物中追蹤其系統(tǒng)的Zn2+活性，這將有助于更好地理解其在植物中的潛在歸宿，從而在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)HLB的有效管理。