XANES測量

圖6顯示了兩種生物雜交物SwMb·1和SwMb·2在CoK吸收邊的XANES光譜，以及1（在乙腈溶液中記錄）和電化學生成的一電子氧化1+（CoIII）在CH3CN中記錄的光譜。后兩者的比較表明，當CoII被氧化為CoI時，以及當配合物中的配位數增加時，會發生顯著的吸收邊向上移動。與1的光譜相比，SwMb·1和SwMb·2的光譜中可以看到這種吸收邊能量藍移。然而，SwMb·1和SwMb·2的XANES光譜中的吸收邊能量仍然比1+（CoII）低約1eV。用CoII（50±10%）和CoIII（50±10%）物種的混合物模擬的光譜再現了在SwMb·1中觀察到的特征。這一結果與EPR數據一致，表明生物雜交物樣品中大約存在1:1的CoII和CoIII混合物。

圖6.（A）SwMb·1（黑色）、SwMb·2（藍色）、配合物1（綠色）和電化學生成的1+（CoIII，紅色）在CoK吸收邊的歸一化XANES光譜。（B）前吸收邊區域的放大圖。所有樣品的光譜在20K下收集，除了1+在室溫下收集。

同時，圖6中聚焦于前吸收邊區域的插圖清楚地顯示，與鈷（III）配合物相比，鈷（II）配合物中四極允許的1s→3dx2-y2躍遷強度更高。前者有兩個前吸收邊特征，而后者只有一個弱特征（圖6B）。基于四極允許躍遷的性質，可以推斷出（i）鈷（III）很可能是低自旋物種，只有一個（或一組）空3d軌道和近乎對稱的八面體幾何結構，以及（ii）鈷（II）的配位幾何結構對稱性較低，具有高自旋態，顯示至少兩個空3d軌道能級。兩種生物雜交物的前吸收邊區域強度低于1（圖6A,B中的插圖），表明生物雜交物中的配位球更對稱。

然而，在1的低溫數據中沒有第二個前吸收邊特征的跡象，表明1（3d7）在20K時具有低自旋態，只有一組空且幾乎等能的3d軌道。這種依賴于溫度的自旋態形成在鐵物種中常見。更高的前吸收邊強度也表明1中存在一些3d-4p混合，但生物雜交物中的這種混合減少，這可能是因為當鈷（II）和鈷（III）物種結合到蛋白質基質時，都獲得了更對稱的配位球，很可能是八面體幾何結構。

結構研究

EXAFS

圖7顯示了兩種生物雜交物SwMb·1和SwMb·2的EXAFS和傅里葉變換EXAFS光譜，以及1的光譜。圖7（頂部）顯示的振蕩幅度表明，與1相比，生物雜交物樣品中與鈷中心配位的最近鄰原子數可能增加，和/或最近鄰距離更均勻。除了鈷配位數可能增加外，在將1插入SwMb時，在鈷中心與第一個配位原子之間的距離方面沒有觀察到重大的結構變化。從1的傅里葉變換光譜（圖7（底部））可以得出相同的信息，其中最高峰對應于最近的Co-N或Co-O距離，即四個赤道配體以及一個或兩個軸向配體。在SwMb·1和SwMb·2的光譜中，該峰的強度明顯高于1的光譜，表明配位數增加（歸因于His93，見下文）和/或鈷中心與赤道和軸向配體之間的鍵距更均勻。

圖7.（頂部）SwMb·1（黑色）、SwMb·2（藍色）和配合物1（綠色）的k3加權EXAFS光譜。（底部）相應的傅里葉變換幅度。所有光譜在20K下記錄。

圖8.SwMb·1（{Co(dmgBF2)2}部分，綠色）和SwMb·2（{Co(dmgH)2}部分，紫色）生物雜交物中鈷配合物結合位點的疊加。來自多肽鏈，僅表示了His93（底部）和His64（頂部）。

對接

最初使用MM能量函數進行對接計算，以確定{Co(dmgBF2)2}和{Co(dmgH)2}部分在SwMb腔內可能的容納情況。His93與兩個部分的鈷中心的配位明顯比與腔內存在的其他組氨酸（His64）殘基的配位更穩定。根據此模型，一個軸向水分子在His93的反位配位，并使用QC/MM勢能優化系統，QC區域包含鈷配合物和配位組氨酸的側鏈。圖8顯示了兩種生物雜交物中圍繞金屬中心的優化結構的疊加。這些結構的其他表示顯示在圖9。

圖9.SwMb·1（a）和SwMb·2（b）中鈷配合物結合位點的表示，基于QC/MM對接計算。鈷原子顯示為球體（SwMb·1中為綠色，SwMb·2中為紫色）。蛋白質殘基顯示為細線，水分子顯示為紅色球體，氫鍵顯示為黑色虛線。

在該理論水平上，沒有觀察到軸向配體（水或His93）的解離。在SwMb·2的情況下，在配位的水分子和His64之間建立了氫鍵（N···H距離為2.02?）。在SwMb·1的情況下沒有形成這種相互作用，因為較大的配合物1配體將His64位移出氫鍵范圍。表2收集了兩種生物雜交物的優化結構數據，并將其與結構表征的[Co(dpgBF2)2(CH3CN)2]和[Co(dmgH)2pyI]配合物的文獻值進行比較。這些數據與從EXAFS實驗得出的結論完全吻合。

表 2. SwMb·1 和 SwMb·2 的模擬（對接數據）以及 [Co(dmgBF2)2(CH3CN)] 在乙腈隱式溶劑模型中使用 B3LYP 泛函和 TZVP 基組的 DFT 計算，以及實驗（Co K 吸收邊 EXAFS）或鈷肝 X 射線結構的第一鄰近原子鍵長。