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電化學(xué)表征
兩種生物雜交物的循環(huán)伏安圖得益于基于MWCNTs的修飾電極的制備，生物雜交物被吸附在MWCNTs上。用Nafion涂覆所得電極顯著增加了所得電極的穩(wěn)定性，否則電極會立即將生物雜交物釋放到電解質(zhì)溶液中。
圖10.（a）SwMb·1吸附在MWCNTs上并在玻碳電極上用Nafion涂覆，在50mmolL-1Tris-HCl（pH7.5）緩沖液中的循環(huán)伏安圖，掃速為0.1Vs-1。（b）在相同條件下，配合物1吸附在MWCNTs上并在玻碳電極上用Nafion涂覆的循環(huán)伏安圖。
固定在MWCNTs上的SwMb·1在Tris-HCl（pH7.5）緩沖液中記錄的循環(huán)伏安圖（圖10）顯示了一個在-0.48VvsSHE的可逆體系，可歸屬于容納在SwMb中的配合物1的鈷（II）/鈷（I）電對。在相同MWCNT電極上記錄的1的毫摩爾溶液的循環(huán)伏安圖（圖10）顯示了一個在-0.38VvsSHE的可逆信號；即，SwMb·1中的鈷（II）/鈷（I）電對位于比1在相同MWCNT電極上負(fù)100mV的位置。它顯示了一個定義不清且不可逆的信號，起始于-0.38VvsSHE，初步歸屬于{Co-(dmgH)2(H2O)His}部分的鈷（III）/鈷（II）電對。無法識別鈷（II）/鈷（I）的信號，因為它與一個大的、可能是催化的波重疊，起始于-0.6VvsSHE，歸屬于H2釋放。
表 3. 在各種條件下，SwMb·1、SwMb·2、1 和 2 介導(dǎo)的催化 H2 釋放的周轉(zhuǎn)數(shù) (TON)a。
| 化合物 | TON | ||
| [Eu(EGTA)(H2O)]2- (pH 7) | hv / DAF / Tris (pH 7) | hv / [Ru(bipy)3]2+ / 抗壞血酸鹽 (pH 6) | |
| 1 | 2 | 2 | 5 |
| 2 | 2.5 | 8.3 | 7 |
| SwMb·1 | 0.3 | 0.6 | 3.8 |
| SwMb·2 | 3.2 | 5 | 3 |
催化活性
首先使用銪（II）配合物[Eu(EGTA)-(H2O)]2-（10當(dāng)量，0.1mmolL-1）評估了兩種生物雜交物在pH7.0水溶液中催化H2釋放的能力。溶液中的H2濃度用Unisense微型克拉克電極監(jiān)測，如圖11所示，實驗使用SwMb·2和2作為催化劑。數(shù)據(jù)收集在表3中。在這些條件下，對于SwMb·2，還原劑在約5分鐘內(nèi)被消耗，產(chǎn)生H2，產(chǎn)率為65%，對應(yīng)于3.2個周轉(zhuǎn)數(shù)（TON）。SwMb-2在總TON方面略優(yōu)于2，盡管觀察到較慢的初始反應(yīng)速率（圖11）。盡管效率較低，但通過添加銪（II）可以重新啟動H2釋放。相比之下，在相同條件下，SwMb·1僅達到0.3TON，顯著低于1（2TONs）。
圖11.在25°C下，pH7.0的50mmolL-1Tris-HCl緩沖液中，通過添加10當(dāng)量[Eu(EGTA)(H2O)]2-引發(fā)的，由SwMb·2（藍色）和配合物2（紅色）催化的H2釋放時間進程。催化劑濃度為0.01mmolL-1。
H2釋放也在光催化條件下在pH7.0下進行了研究，使用DAF作為光敏劑，其激發(fā)態(tài)可以從Tris-HCl緩沖液中捕獲電子和質(zhì)子，從而產(chǎn)生自由基物種DAFH·。該自由基自發(fā)二聚，但后一反應(yīng)在光照射下是可逆的，產(chǎn)生還原性DAFH的穩(wěn)態(tài)濃度，然后可以將電子轉(zhuǎn)移給鈷基催化劑。在這些條件下，兩種生物雜交物的催化性能與在相同pH下使用[Eu(EGTA)(H2O)]2-作為還原劑時獲得的結(jié)果非常接近。在pH6的磷酸鹽緩沖液中，使用[Ru(bipy)3]2+作為光敏劑，抗壞血酸鹽作為犧牲電子供體，在光催化條件下，SwMb·1獲得了更大的TON（SwMb·1和SwMb·2分別為3.8和3TONs）。
在這些條件下，光催化質(zhì)子還原可能始于光激發(fā)[Ru-(bipy)3]2+被抗壞血酸鹽還原猝滅，生成[RuII(bipy)2(bipy*-)]+，一種強還原劑（E0=-1.12VvsSHE），在這些條件下壽命約為500ns。然后電子可以轉(zhuǎn)移到鈷基催化劑，與[Ru(bipy)3]+和氧化的抗壞血酸鹽之間的電荷復(fù)合競爭，兩者都可以預(yù)期以接近擴散極限的速率發(fā)生。在所有情況下[銪（II）配合物的熱還原或光催化條件]，在添加還原劑后立即觀察到鈷（I）物種的藍色，這支持了上述機制。應(yīng)該注意的是，將鈷肟限制在肌紅蛋白腔內(nèi)強烈限制了H2釋放反應(yīng)的機制，這可能解釋了生物雜交物觀察到的較低活性。實際上，對于游離配合物，兩種機制可能同時發(fā)生：第一種只涉及一個金屬位點，H2通過質(zhì)子化金屬結(jié)合的氫化物配體產(chǎn)生；第二種涉及兩個金屬氫化物分子的雙分子H2消除，在生物雜交物種的情況下完全被排除。
討論
SwMb已被用作構(gòu)建各種人工酶的主體蛋白，這些酶催化有機底物的氧化。鉻（III）、錳（III）、鐵（III）和銅（II）的席夫堿配合物已被插入脫輔基-SwMb主體的腔內(nèi)，它們在那里與組氨酸殘基結(jié)合。在大多數(shù)情況下，His93（它是全SwMb中血紅素的天然配體）在軸向位置配位平面正方形席夫堿配合物，如X射線晶體學(xué)所揭示。鈷肟具有類似于席夫堿配合物的平面正方形幾何結(jié)構(gòu)，并且在它們的軸向位置上對N-雜環(huán)堿基具有良好的親和力。
