因此，本研究中使用的兩種鈷肟1和2在與脫輔基-SwMb反應時形成純凈、分子定義明確且穩定的生物雜交物SwMb·1和SwMb·2。所有光譜數據證實鈷肟被插入折疊的SwMb蛋白的結合口袋內，并與鈷配合物軸向位置上的一個組氨酸殘基配位，從而產生非常高的結合常數。QC/MM對接計算表明，與附近存在的另一個組氨酸殘基（His64）相比，對His93有配位偏好。從這些計算中提取的結構數據與從兩種生物雜交物的EXAFS測量中獲得的數據非常吻合。在這兩種情況下，鈷中心似乎是六配位的，有一個水分子，通過軸向His93與蛋白質結合的鈷肟配合物完成了配位球。在SwMb·2的情況下，配位的水分子與His64形成氫鍵。

圖12.（a）g_z與g_x和（b）g_x與A_z(59Co)的相關圖，數據來自表1，適用于{Co(dmgBF2)2}部分在不同環境中。紅線對應質子和極性介質（甲醇/水），藍線對應非質子和非極性介質（甲苯）。SwMb·1的數據點用綠色方塊表示。

當鈷肟插入肌紅蛋白腔內時，其疏水環境通過比較從SwMb·1的EPR光譜中提取的g值與先前報道的{Co(dmgBF2)2}部分在各種化合物或介質中的g值得到證明。圖12所示的圖形表示確實顯示了g_z和g_x之間以及g_x和A_z之間兩種不同的相關特征，這取決于介質的性質（質子和極性，紅線；非質子和非極性，藍線）。為SwMb·1測量的g值以及與59Co和14N核的超精細耦合常數接近兩條表示中的藍線。特別是，觀察到的值與在非常疏水的環境甲苯中測量的{Co(dmgBF2)2}與吡啶修飾的苝二亞酰胺（p-PDI）加合物的值非常相似。p-PDI通過吡啶部分軸向配位到鈷肟，從而模擬生物雜交物中的組氨酸配位。這種相關性對于表征相關蛋白質系統（例如基于光系統I的雜化復合物）中鈷肟部分的直接環境將非常有價值。

所有這些數據提供了明確的證據，表明鈷肟結合在脫輔基肌紅蛋白血紅素口袋中，并且僅與結合口袋中可用的兩個組氨酸中的一個配位。從對接研究中沒有證據表明與位于口袋中的氨基酸殘基存在其他相互作用，但我們注意到鈷肟配體缺乏通過氫鍵和疏水相互作用分別穩定肌紅蛋白中血紅素輔基的丙酸酯和乙基殘基。

在生物雜交物修飾的CNT電極上的電化學測量證明了兩種生物雜交物中鈷中心的氧化還原活性。鈷（II）/鈷（I）電對的電位受蛋白質環境顯著影響，負移100mV。在SwMb·2的情況下，在pH7記錄的循環伏安圖表明對H2釋放具有催化活性，起始電位為-0.6vsSHE，因此對應于約200mV的過電位要求。

由于生物雜交物修飾的CNT電極的低穩定性阻礙了詳細的電催化研究，我們轉向溶液測定來評估生物雜交物的催化性能。我們使用了兩種不同的條件組，在pH7.0下，基于催化劑被銪（II）配合物[Eu(EGTA)(H2O)]2-還原劑熱還原（E0Eu(II)/Eu(III)=-0.88vsSHE對應于在本研究中使用的銪（II）濃度下EEu(II)/Eu(III)=-0.64到-0.70vsSHE；H2釋放的驅動力為~220-280mV）或催化劑被光生DAFH自由基光驅動還原（E°=-0.65VvsSHE；H2釋放的驅動力為~240mV）。在這兩種情況下，催化的驅動力因此僅略高于循環伏安法測量指示的過電位要求。因此，SwMb·2在銪（II）配合物的熱還原和光催化條件下都顯示出催化活性。

相比之下，SwMb·1在pH7時基本上沒有活性。與配合物1相比，生物雜交物中活性的降低可能與將配合物摻入蛋白質中引起的鈷（II）/鈷（I）過程100mV的陰極位移有關。將pH值降低到6，并使用[Ru(bipy)3]2+作為光敏劑，抗壞血酸鹽作為犧牲電子供體，可以觀察到SwMb·1的催化活性（TON=3.8）。配合物1催化H2釋放需要酸性pH值在本研究之前已有報道。Connolly和Espenson最初報道了1使用鉻（II）、釩（II）或銪（II）鹽作為電子源在HCl溶液（pH<1）中的高效H2釋放活性。

Szajna-Fuller和Bakac使用檸檬酸鈦（III）作為電子源的進一步報告表明，在pH>4時觀察不到活性。因此，我們的結果證實了先前的觀察，即只有質子橋連的鈷肟（與配合物2相關）才能作為在中性到堿性條件下H2釋放的催化劑。更酸性的條件（pH<5）可能會提高SwMb-1的H2釋放催化活性。不幸的是，肌紅蛋白在這樣的條件下不穩定，會發生去折疊，并且輔因子會釋放到溶液中。

具有約200mV范圍內的過電位要求，鈷肟基人工氫化酶因此被證明與鈷卟啉基生物雜交物具有競爭力，后者需要更高的驅動力（>800mV）來催化pH7下的H2釋放。它們不幸在周轉過程中的穩定性要差得多，可能是因為二肟配體的還原導致其不可逆的氫化（和催化劑失活），而卟啉可以作為可逆的電子庫。

然而，兩種新型人工氫化酶SwMb·1和SwMb·2與基于二硫醇橋連的六羰基二鐵催化單元的其他人造酶相當，這些催化單元共價連接到多肽或摻入細胞色素c中。在這些系統中，發現更大的多肽增強了催化活性，指出了整個蛋白質環境的重要性，如本研究所描述。已顯示這種生物雜交系統在水性條件下和存在[Ru(bpy)3]2+作為光敏劑和抗壞血酸鹽作為犧牲電子供體的情況下催化光驅動H2釋放，導致總TON為5-9（相對于催化劑）在中性到堿性pH下。

這種有限穩定性的原因可以從機理考慮中得出。在鈷肟介導的H2釋放的情況下，催化機制始于鈷（I）物種的質子化，產生CoIII-H物種。我們注意到，在涉及SwMb·1和SwMb·2的催化測定中，最初觀察到藍色，歸屬于鈷（I）或CoIII-H物種。然而，需要還原這種CoIII-H物種才能發生催化。然后氫氣通過CoII-H物種的快速質子化異裂產生。周轉期間觀察到的有限穩定性可能源于催化中間體（如CoIII-H物種）的失活。

有人提出，從后一種物種的氫化物轉移導致乙二肟配體的氫化，并伴隨催化活性的喪失。因此，如果能夠限制兩個連續電子轉移過程之間的延遲，預計會有更高的活性和穩定性。這種快速的電子注入很可能發生在光系統I/鈷肟生物雜交系統中，并解釋了其異常穩定性。在二硫醇橋連的六羰基二鐵催化單元和鎳雙二膦配合物的情況下，已證明光敏劑和催化單元之間的超分子控制電子通信是有益的。

結論

許多金屬中心已被摻入SwMb（和其他血紅素蛋白）中以創建功能性催化劑。令人驚訝的是，該策略僅應用于氧化催化劑，從未用于制備人工氫化酶。我們在此表明，鈷肟可以通過與結合口袋中可用的兩個組氨酸中僅一個的配位輕松安裝到肌紅蛋白中。所得生物雜交物在水性條件下顯示出H2釋放的催化活性，并且過電位要求低（~200mV），這對于進一步的生物技術應用至關重要，因為該參數直接影響電化學設備的能量效率。操作穩定性（技術實施的另一個關鍵要求）似乎僅限于幾個周轉，正如迄今為止描述的大多數人工氫化酶所觀察到的那樣。這可以通過增強與電子供體的電子通信（如上所述）或活性位點工程來改善。后者先前已為其他人工金屬酶實現，一些基于肌紅蛋白支架，通過點突變或探索可以結合這些和其他合成鈷催化劑的多種血紅素蛋白的多樣性。