混合尺寸微電極陣列實現并行可靠的動作電位記錄


為了避免不同基底上細胞生長狀態和生長環境帶來的差異，我們還使用微加工工藝在同一基底上制造了具有不同尺寸（20、50、100、200和400微米）微電極的混合尺寸微電極陣列（圖5a）。在微電穿孔過程中，微電極與細胞內部環境接觸之前，記錄到的細胞外場電位表現出雙相尖峰模式。幅度在100-300微伏之間，類似于傳統平面微電極的測量值（圖5b-f上部）。在施加3V脈沖電壓誘導細胞膜形成瞬時納米孔后，混合尺寸微電極陣列能夠進入細胞內環境。混合尺寸微電極陣列記錄的電信號從細胞外場電位的細胞外雙相尖峰模式轉變為細胞內動作電位的單脈沖波形。


細胞內動作電位展示了類似于傳統膜片鉗技術測量的去極化和復極化過程（圖5b-f下部）。如圖5g所示，微電穿孔可以高效地將細胞外場電位轉換為幾乎所有通道的細胞內動作電位。此外，熱圖表明，從不同尺寸微電極獲得的細胞外場電位和細胞內動作電位的信號幅度存在顯著差異。同樣如圖5h所示，從不同尺寸微電極記錄的細胞內動作電位波的搏動頻率和波形高度相似。比較同一時期疊加波形中上升支的開始點，發現了不同程度的相移（圖5i），最大相移時間約為60毫秒。相移時間是心肌細胞內動作電位傳播所需的時間。最后，如圖5j所示，對多尺寸電極記錄的細胞內動作電位進行分割，這允許以高時間分辨率分析心肌細胞在不同時間點的動作電位幅度（圖5k）。

圖5. 混合尺寸微電極陣列實現并行可靠的動作電位記錄。

a 包含五種尺寸微電極的混合尺寸微電極陣列光學圖像。

b-f 混合尺寸微電極陣列記錄的典型細胞外場電位（上部）和細胞內動作電位（下部）波形：(b) 20微米，(c) 50微米，(d) 100微米，(e) 200微米，(f) 400微米微電極。

g 混合尺寸微電極陣列記錄的所有通道在微電穿孔前后（左：場電位，右：動作電位）的信號幅度熱圖。

h 從不同尺寸微電極記錄的典型細胞內動作電位波形疊加。

i 從不同尺寸微電極記錄的典型細胞內動作電位波形在上升支開始點對齊疊加，顯示相移。

j 從多尺寸電極記錄的細胞內動作電位分割示意圖。

k 從多尺寸電極記錄的心肌細胞在不同時間點的細胞內動作電位幅度熱圖。


評估混合尺寸微電極陣列和多尺寸微電極陣列記錄的電信號


為了探索在混合尺寸微電極陣列中使用微電極尺寸對心肌細胞細胞內動作電位記錄的影響，我們評估了電生理信號的多個參數和指標。這些指標共同評估了微電極尺寸如何影響細胞內動作電位記錄的質量。如圖6a所示，細胞內動作電位峰峰值隨著電極尺寸的增加而增加。動作電位峰峰值從20微米時的88.94±11.06微伏增加到400微米時的192.15±20.60微伏，增加了約116%。分析細胞內動作電位峰峰值與細胞外場電位峰峰值的比值表明，不同尺寸微電極的幅度比值沒有顯著差異，這可能是因為穿孔前后細胞與微電極的接觸面積幾乎沒有變化（圖6b）。

圖6. 混合尺寸微電極陣列與多尺寸微電極陣列記錄的電信號評估。

a-h 混合尺寸微電極陣列記錄的電信號參數統計：(a) 細胞內動作電位峰峰值，(b) 細胞內動作電位峰峰值/細胞外場電位峰峰值比值，(c) 細胞外場電位和細胞內動作電位信噪比，(d) 動作電位持續時間，(e) 搏動頻率，(f) 50%動作電位持續時間，(g) 單細胞信號比例，(h) 動作電位產率。統計圖每組分析n=10或4個數據，以均值±sem表示。顯著性差異通過單因素方差分析，，p<0.05；，p<0.01；，p<0.001；，p<0.0001；NS，無統計學意義。


i-m 混合尺寸微電極陣列與多尺寸微電極陣列中不同尺寸微電極參數雷達圖對比：(i) 20微米，(j) 50微米，(k) 100微米，(l) 200微米，(m) 400微米微電極。n,o 不同微電極尺寸對混合尺寸微電極陣列(n)和多尺寸微電極陣列(o)中電信號多個參數影響的熱圖，包括：細胞內動作電位峰峰值、動作電位/場電位峰峰值比值、場電位信噪比、動作電位信噪比、動作電位持續時間、50%動作電位持續時間、單細胞動作電位信號比例、動作電位產率。顏色表示參數值相對于各參數最大值的歸一化值。


隨后，分析了不同尺寸微電極的信噪比。如圖6c所示，微電穿孔前后的細胞外場電位和細胞內動作電位信噪比隨著微電極尺寸的增加而逐漸增加。場電位信噪比從20微米微電極的12.17±0.58分貝增加到400微米微電極的25.52±0.51分貝，增加了約110%。動作電位信噪比從20微米微電極的17.32±1.44分貝增加到400微米微電極的29.27±0.99分貝，增加了約70%。這一結果與在多尺寸微電極陣列中觀察到的信噪比趨勢一致。由于微電穿孔過程的可逆性，細胞膜中的納米孔隨時間逐漸關閉。如圖6d所示，動作電位持續時間隨著微電極尺寸的增加而逐漸減少。動作電位持續時間從20微米微電極的60.46±2.07毫秒減少到400微米電極的50.90±2.62毫秒，減少了約15.00%。