摘要

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)會(huì)導(dǎo)致睡眠期間間歇性缺氧(IH)。肥胖和OSA都與胰島素抵抗和全身炎癥有關(guān)，這可能是組織缺氧造成的。我們假設(shè)，缺氧暴露模式?jīng)Q定了外周組織的氧概況和全身代謝結(jié)果，而肥胖具有調(diào)節(jié)作用。將瘦小和肥胖的C57BL6小鼠間歇性缺氧12小時(shí)60次/小時(shí)(IH60)[吸入氧氣分?jǐn)?shù)(FIO2)21-5%，60/小時(shí)]、12次/小時(shí)(FIO2-5%，15秒，12/小時(shí))、持續(xù)性缺氧(SH；FIO2-10%)或禁食時(shí)的常缺氧。測量了肝臟、骨骼肌和附睪脂肪中的組織氧分壓(PtiO2)、血漿瘦素、脂肪連素、胰島素、血糖和脂肪腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。在瘦小鼠中，IH60會(huì)導(dǎo)致肝臟中的氧波動(dòng)，而肌肉中的PtiO2波動(dòng)減弱，脂肪中的PtiO2波動(dòng)消失。在肥胖小鼠中，肝臟基線PtiO2低于瘦小鼠，而肌肉和脂肪的PtiO2沒有差異。在IH期間，肥胖小鼠和瘦小鼠的PtiO2相似。所有缺氧方案都會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗。在瘦小鼠中，缺氧會(huì)顯著增加瘦素，尤其是在SH期間(44倍)；IH60(而非SH)會(huì)誘導(dǎo)脂肪分泌的TNF-a增加2.5至3倍。肥胖與瘦素和TNF-a的顯著增加有關(guān)，而瘦素和TNF-a的增加壓倒了缺氧的影響。總之，IH60導(dǎo)致肝臟和肌肉的氧波動(dòng)以及脂肪的穩(wěn)定缺氧。IH和SH會(huì)誘發(fā)胰島素抵抗，但只有IH60會(huì)加重瘦小鼠的炎癥。肥胖會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥，但急性缺氧療法不會(huì)加劇炎癥。

引言

間歇性缺氧是阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的一個(gè)明顯特征，被認(rèn)為是代謝功能障礙發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)主要因素。然而，盡管有大量關(guān)于代謝和心血管結(jié)果的文獻(xiàn)，但人們對(duì)間歇性缺氧時(shí)組織氧分壓(PtiO2)的變化幾乎一無所知。

大多數(shù)OSA患者都很肥胖。肥胖本身會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗、2型糖尿病、全身炎癥、氧化應(yīng)激和不良的心血管后果。脂肪組織缺氧與肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗和全身炎癥有關(guān)。肥胖者脂肪組織中的氧含量明顯低于正常體重者。其他胰島素敏感組織(如肝臟和骨骼肌)中的氧含量尚未在肥胖者和瘦弱者中進(jìn)行比較。

本研究的作者們建立了一種間歇性缺氧小鼠模型，再現(xiàn)了OSA患者夜間的血氧狀況，并證明慢性間歇性缺氧會(huì)誘發(fā)小鼠的胰島素抵抗、全身炎癥和氧化應(yīng)激。然而，人們對(duì)OSA和間歇性缺氧的多個(gè)方面仍然知之甚少。OSA的代謝結(jié)果與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，但這種關(guān)系在動(dòng)物模型中尚未得到充分研究。在相同的間歇性缺氧頻率下，SpO2(脈搏血氧飽和度測量法測量的血氧飽和度)的最低點(diǎn)越嚴(yán)重，肝臟氧化應(yīng)激和血脂異常越嚴(yán)重，但間歇性缺氧頻率對(duì)組織氧氣水平和代謝結(jié)果的影響尚未在動(dòng)物模型中進(jìn)行系統(tǒng)研究。

在本研究中，瘦小鼠和肥胖小鼠暴露于兩種不同的間歇性缺氧方式：12次/小時(shí)和60次/小時(shí)，以及持續(xù)缺氧，并測量了1)血液、肝臟、肌肉和附睪脂肪中的實(shí)時(shí)氧含量；2)胰島素抵抗指標(biāo)，包括空腹血糖和血漿胰島素水平，以及影響胰島素抵抗的脂肪因子、瘦素和脂肪連通素的水平；3)氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)。我們選擇了研究人員常用的間歇性和持續(xù)性缺氧方案。

我們假設(shè)，缺氧暴露方案決定了外周組織的氧概況和全身代謝結(jié)果，而肥胖具有調(diào)節(jié)作用。

方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。研究共使用了143只6至8周大的雄性瘦C57BL/6J小鼠，這些小鼠購自杰克遜實(shí)驗(yàn)室。72只小鼠用于檢測所有報(bào)告的代謝變化、氧化應(yīng)激和炎癥。48只動(dòng)物用于免疫印跡和缺氧探針的免疫組織染色。23只小鼠僅用于評(píng)估動(dòng)脈血和代謝活躍組織中的氧含量。瘦小鼠食用普通飼料，而肥胖小鼠食用高脂肪飼料(TD03584，5.4千卡/克，脂肪含量35.2%，58.4%的千卡來自脂肪)。小鼠飼養(yǎng)在光-暗調(diào)節(jié)的環(huán)境中，從上午9點(diǎn)到晚上9點(diǎn)為12小時(shí)的光照階段。所有測量均在小鼠25-30周齡時(shí)進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。本研究的作者開發(fā)了一種小鼠間歇性缺氧模型，如前所述。簡而言之，他們設(shè)計(jì)了一個(gè)氣體控制輸送系統(tǒng)來調(diào)節(jié)進(jìn)入籠子的室內(nèi)空氣、氮?dú)夂脱鯕獾牧髁俊Ｔ陂g歇性缺氧60次/小時(shí)期間，吸入的氧氣分?jǐn)?shù)在30秒內(nèi)從20.9%降至5%，然后在隨后的30秒內(nèi)復(fù)氧至室內(nèi)空氣水平，結(jié)果每小時(shí)發(fā)生60次缺氧事件。在每小時(shí)12次的間歇性缺氧過程中，吸入的氧氣分?jǐn)?shù)在20秒內(nèi)從20.9%降至5%，隨后的15秒內(nèi)保持在5%，然后迅速復(fù)氧至室內(nèi)空氣水平。這種循環(huán)每5分鐘重復(fù)一次，結(jié)果每小時(shí)發(fā)生12次缺氧事件。在持續(xù)的等壓低氧狀態(tài)下，吸入氧氣的比例持續(xù)降低到10%。正常缺氧小鼠持續(xù)暴露于室內(nèi)空氣中。除評(píng)估氧曲線外，所有測量都是將小鼠暴露在常氧、間歇性缺氧12次/小時(shí)、間歇性缺氧60次/小時(shí)或持續(xù)缺氧環(huán)境中一個(gè)晚上(12小時(shí))，同時(shí)禁食。暴露結(jié)束前30分鐘，通過尾部放血測量未麻醉小鼠的血糖。暴露結(jié)束后，立即用1-2%的異氟醚對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，并獲取血液、肝臟、肌肉和附睪脂肪以進(jìn)行進(jìn)一步分析。第二組是11只瘦小鼠和12只肥胖小鼠，它們以前沒有進(jìn)行過缺氧調(diào)節(jié)，在不同的缺氧方案中，使用快速反應(yīng)氧微電極(OX-50，UnisenseA/S，直徑50μm，90%反應(yīng)時(shí)間＜5秒)測量肝臟、肌肉和附睪脂肪中的PtiO2，同時(shí)使用小鼠領(lǐng)夾進(jìn)行無創(chuàng)脈搏血氧測量。根據(jù)制造商的協(xié)議，在對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行測量之前和之后都要對(duì)氧微電極進(jìn)行校準(zhǔn)。在此過程中，小鼠腹腔注射1.5克/千克尿烷進(jìn)行麻醉。將小鼠的鼻子從一個(gè)孔中放入與第一組小鼠相同的籠子中。然后切開不同組織上的皮膚，以便用探針測量組織含氧量。將氧微電極安裝在微型機(jī)械手上，垂直插入距表面2毫米處，然后稍稍回縮至可獲得穩(wěn)定PtiO2信號(hào)的位置。在將氧微電極移動(dòng)到同一組織的不同位置或不同組織之前，按上述方法進(jìn)行所有三種缺氧方案和常氧方案的測量，并在同一位置進(jìn)行記錄。正常缺氧和持續(xù)缺氧的測量時(shí)間至少為2分鐘，間歇性缺氧的測量時(shí)間至少為5分鐘。總體而言，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都進(jìn)行了多次測量(三種組織的四種實(shí)驗(yàn)方案)。

缺氧探針。缺氧探針的免疫組化染色是根據(jù)生產(chǎn)商提供的試劑盒進(jìn)行的。簡而言之，在組織采集前30分鐘，按60mg/kg體重腹腔注射Hypoxyprobe-1，同時(shí)繼續(xù)暴露于低氧或常氧環(huán)境中。新鮮組織用10%緩沖福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋。使用與FITC結(jié)合的Hypoxyprobe-1一抗和與辣根過氧化物酶結(jié)合的抗FITC二抗進(jìn)行免疫組織染色。為了進(jìn)行Western印跡，將新鮮肝臟、肌肉和附睪脂肪立即冷凍在液氮中。使用Bio-Rad預(yù)制凝膠系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡。蛋白質(zhì)(20μg)用于每個(gè)泳道。我們使用Hypoxyprobe-1抗體作為一抗。

生物化學(xué)。空腹血漿總膽固醇和甘油三酯、血糖用試劑盒檢測。血漿胰島素和瘦素、脂肪連素使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測評(píng)估。丙二醛用檢測試劑進(jìn)行測量。為了測量體內(nèi)腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的分泌，將附睪脂肪組織片段在含有1%BSA的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時(shí)。用ELISA試劑盒評(píng)估培養(yǎng)基中的TNF-a水平。在進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)時(shí)，使用TRIzol從肝臟中提取總RNA，并使用Advantage RT for PCR試劑盒合成互補(bǔ)DNA。使用特異于TNF-a的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，如前所述。mRNA表達(dá)水平通過標(biāo)準(zhǔn)ΔΔCt方法(http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html)與18S核糖體RNA濃度進(jìn)行歸一化，如我們實(shí)驗(yàn)室之前所做的那樣，然后表示為相關(guān)樣本中mRNA與常氧小鼠平均mRNA水平的比值。

數(shù)據(jù)分析。分析使用Stata 9.0版本進(jìn)行。數(shù)據(jù)以均值±SE表示。使用兩樣本W(wǎng)ilcoxon秩和(Mann-Whitney)檢驗(yàn)比較瘦小鼠和肥胖小鼠的血氧水平。氧水平平均方差的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。在瘦或肥胖表型中，低氧和常氧條件下代謝和炎癥指數(shù)的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。瘦小鼠和肥胖小鼠之間代謝和炎癥指標(biāo)的比較采用一般線性模型方差分析。P值小于0.05為差異顯著。